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第一章 绪论1

第一节 组织化学发展的基础1

一、细胞生物学发展与组织化学1

二、生物化学发展与组织化学2

三、免疫学发展与组织化学2

四、分子生物学发展与组织化学3

第二节 组织化学发展简史3

一、组织化学的兴起3

二、现代组织化学的发展4

三、我国组织化学发展概况5

第三节 组织化学技术基本要求6

一、组织化学的分支和分类6

二、组织化学技术的基本要求7

第二章 组织化学与免疫组织化学染色样品制备8

第一节 取材8

一、组织标本取材8

二、细胞标本取材9

（一）培养细胞9

（二）涂片法9

第二节 固定9

一、组织和细胞的固定方法9

（一）浸润法9

（二）灌流固定法9

二、常用固定剂和固定方法10

（一）组织常用固定剂和固定方法10

（二）培养细胞常用固定剂和固定方法11

第三节 包埋和切片11

一、石蜡包埋11

（一）包埋前脱水12

（二）透明12

（三）浸蜡12

（四）包埋12

（五）修块12

二、切片12

（一）石蜡切片12

（二）冰冻切片13

（三）振动切片14

三、防脱片处理步骤14

（一）载玻片和盖玻片的处理14

（二）黏附剂的使用14

（三）免疫组织化学染色中常见脱片原因15

科学史话——幽门螺杆菌与胃溃疡15

第三章 组织化学18

第一节 核酸组织化学18

一、Feulgen反应18

（一）原理18

（二）Schiff液的配制19

（三）Feulgen反应步骤19

二、吖啶橙染色20

（一）吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法20

（二）吖啶橙原位区分组织细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法21

三、Hoechst 33258染色22

四、DAPI染色23

五、溴化乙啶和碘化丙啶染色法24

（一）溴化乙啶染色24

（二）碘化丙啶染色25

第二节 脂类组织化学25

一、乙醇苏丹黑B染色法26

（一）染色程序26

（二）注意事项26

二、油红O染色法26

（一）油红O染液的配制27

（二）染色程序27

第三节 酶组织化学27

一、酶组织化学的基本原理及一般原则27

（一）酶组织化学的基本原理27

（二）酶显示方法28

（三）酶组织化学对组织处理的基本要求29

二、常用酶组织化学染色方法30

（一）磷酸酶30

（二）三磷酸腺苷酶34

（三）羧酸酯水解酶35

（四）氧化酶和脱氢酶37

（五）一氧化氮合酶40

第四节 凝集素组织化学41

一、凝集素的标记物42

二、染色程序42

（一）FITC标记凝集素的组织化学染色程序42

（二）辣根过氧化物酶标记凝集素的组织化学染色程序42

（三）生物素标记凝集素的组织化学染色程序43

第五节 荧光组织化学43

一、组织细胞荧光分类44

（一）自发荧光44

（二）诱发荧光44

（三）酶促荧光44

（四）荧光染色44

（五）免疫荧光44

二、生物胺荧光组织化学44

（一）Falck-Hillarp甲醛诱发荧光法45

（二）乙醛酸诱发生物单胺荧光法45

（三）邻苯二醛显示组胺荧光法46

科学史话——周期蛋白的发现47

第四章 免疫组织化学技术50

第一节 免疫组织化学基本原理50

一、直接法50

二、间接法51

三、亲和免疫组织化学51

（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法52

（二）链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法53

第二节 免疫组织化学染色步骤54

一、SABC法免疫组织化学染色步骤54

（一）石蜡切片免疫组织化学染色54

（二）冰冻切片免疫组织化学染色57

（三）培养细胞免疫细胞化学染色57

二、SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较58

（一）SP法或SAP法58

（二）EnVision TM Systems58

（三）MaxVision法58

三、免疫组织化学染色结果评价59

（一）以抗原表达模式定位59

（二）阳性染色结果定量59

四、讨论59

（一）实验计划59

（二）抗体的稀释度60

（三）滴加抗体注意事项60

（四）抗体的保存60

（五）对照实验61

（六）免疫组织化学技术应用的基本原则61

（七）疑难问题剖析62

第三节 免疫组织化学双重染色64

第四节 免疫荧光组织化学技术65

一、荧光的基本知识65

（一）荧光65

（二）荧光物质的特性和种类65

二、免疫荧光组织化学基本原理及方法69

（一）基本原理69

（二）基本方法69

三、免疫荧光组织化学染色步骤71

（一）直接法71

（二）间接法71

（三）SABC-Cy3法72

（四）双重染色法72

（五）膜抗原荧光抗体染色法73

（六）补体法73

（七）荧光抗体再染色法74

四、非特异性荧光染色的消除74

五、生物荧光显微镜75

（一）荧光显微镜的分类及主要组成75

（二）荧光显微镜的基本操作及注意事项77

六、激光扫描共聚焦显微镜78

（一）激光扫描共聚焦显微镜基本原理78

（二）激光扫描共聚焦显微镜操作步骤及注意事项79

（三）组织芯片中免疫荧光染色的定量分析81

应用举例——免疫荧光组织化学双重染色在神经元发生研究中的应用82

第五章 原位杂交组织化学84

第一节 原位杂交组织化学基本原理84

一、核酸的化学组成与基本结构84

二、DNA变性与复性85

（一）变性85

（二）复性86

第二节 核酸分子杂交86

第三节 核酸分子探针87

一、探针的种类87

（一）基因组DNA探针88

（二）cDNA探针88

（三）cRNA探针88

（四）寡核苷酸探针88

二、探针的标记90

（一）探针标记物90

（二）探针标记方法90

第四节 原位杂交组织化学基本程序93

一、标本制备94

（一）取材94

（二）固定94

（三）切片95

二、杂交前处理96

（一）增强组织通透性和核酸探针穿透性96

（二）减低背景染色96

三、杂交反应97

（一）双链DNA探针和靶DNA变性97

（二）杂交液97

（三）探针长度97

（四）探针浓度97

（五）杂交温度和时间98

（六）杂交严格度98

四、杂交后处理98

五、杂交体检测99

（一）放射性核素标记探针的检测99

（二）非放射性标记探针的检测99

六、对照实验100

（一）组织对照100

（二）探针对照100

（三）杂交反应对照101

（四）检测系统对照101

第五节 原位杂交组织化学技术进展101

一、原位PCR技术101

二、荧光原位杂交技术103

三、胚胎原位杂交技术104

四、双重和多重原位杂交技术104

（一）放射性核素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交105

（二）非放射性标记探针的双重标记原位杂交105

（三）两种放射性核素标记探针的双重标记原位杂交106

五、原位杂交结合免疫组织化学技术106

六、电镜原位杂交技术107

（一）电镜原位杂交的特点108

（二）常用电镜原位杂交技术的基本程序109

七、肽核酸原位杂交109

科学史话——割裂基因的发现110

第六章 电镜组织化学与免疫电镜技术113

第一节 电镜技术113

一、透射电子显微镜基本原理113

二、超薄切片技术113

（一）固定113

（二）脱水116

（三）浸透与包埋116

（四）超薄切片制作118

三、观察与记录120

第二节 电镜组织化学技术122

一、基本原理122

（一）酶组织化学反应过程122

（二）酶反应底物的特异性122

（三）捕捉反应122

二、样品制备122

三、结果观察123

第三节 免疫电镜技术124

一、免疫电镜技术的特点124

（一）组织取材与固定124

（二）染色方法124

（三）包埋126

（四）对照实验127

二、几种常用电镜免疫染色技术127

（一）免疫铁蛋白电镜技术127

（二）免疫酶电镜技术128

（三）免疫胶体金电镜技术130

（四）免疫纳米金电镜技术132

第七章 组织化学与免疫组织化学定量分析技术135

第一节 显微图像分析135

一、显微图像分析系统组成136

二、基本术语和常用测量参数136

（一）像素与灰度136

（二）色彩136

（三）光密度137

（四）长度137

（五）面积137

三、吸光和发光组织样品的常用测量参数137

（一）吸光组织细胞样品的测量137

（二）发光组织细胞样品的测量137

四、显微图像分析处理程序138

（一）制作切片样品138

（二）获取图像138

（三）图像分割138

（四）测量139

（五）统计分析139

（六）结果输出139

五、显微图像分析应用中的注意事项139

（一）设计在先，测试在后139

（二）测试样本的代表性139

（三）实验操作过程的一致性140

（四）图像分析系统输入条件的一致性140

（五）图像分析系统现有参数的局限性140

（六）二维定量信息的局限性140

第二节 流式细胞术140

一、流式细胞仪的工作原理140

二、流式细胞术在组织化学与免疫组织化学中的应用141

（一）流式细胞术的常用样品制备方法142

（二）免疫荧光标记样品143

（三）流式细胞术数据处理与分析144

（四）运用流式细胞仪计数细胞应注意的问题145

第三节 激光扫描共聚焦显微镜技术146

一、激光扫描共聚焦显微镜在组织化学和免疫组织化学中的应用146

（一）光学切片147

（二）三维图像重建147

（三）荧光标记物的定位和定量分析148

二、激光扫描共聚焦显微镜定量分析的优势150

三、注意事项150

（一）制备高特异性和高效价的荧光抗体150

（二）标本制作要求151

（三）定量研究的要求151

第四节 体视学151

一、体视学的基本概念及基本原则152

（一）二维图像与三维结构之间的关系152

（二）几何探针152

（三）卡瓦列里原理154

（四）随机抽样157

二、常用体视学方法在免疫组织化学中的应用161

（一）特征物断面计数与轮廓密度161

（二）长度密度和总长度163

（三）面积分数、平均面积、体积分数和总体积165

（四）交叉点密度、边线密度、表面积密度和总表面积167

（五）数目测量168

应用举例——体视学在雌激素替代治疗改善老年大脑功能研究的应用176

第八章 显微摄影技术178

第一节 摄影基础178

一、照相机镜头179

（一）照相机镜头口径179

（二）照相机镜头种类与焦距179

二、控制曝光180

（一）光圈180

（二）快门181

（三）胶片的感光度182

三、景深182

（一）光圈口径对景深的影响182

（二）镜头焦距对景深的影响182

（三）物距对景深的影响182

四、感光片182

（一）彩色负片182

（二）彩色反转片182

（三）感光度183

（四）反差183

五、常用滤色镜的作用183

（一）原色光和补色光183

（二）滤色镜的特性183

（三）滤色镜在摄影中的应用184

六、色温184

第二节 显微摄影基础185

一、显微镜的几何光学成像原理185

二、分辨率与放大率185

三、显微镜的主要部件187

（一）视场光阑和孔径光阑187

（二）聚光镜188

（三）物镜188

（四）目镜189

四、柯勒照明190

五、几种常用特殊显微镜的结构与原理190

（一）相差显微镜190

（二）微分干涉显微镜193

第三节 显微摄影技术应用195

一、普通显微摄影技术应用195

（一）显微镜的使用环境195

（二）摄影前准备195

（三）显微照相的操作步骤196

（四）胶卷的选用197

（五）显微照片放大倍数的标注方法197

二、特殊显微摄影技术应用197

三、数码显微摄影技术198

（一）数码摄影的基本原理198

（二）数码显微摄影技术应用202

参考文献204

第九章 组织化学与免疫组织化学实验指导206

实验一 组织标本石蜡切片和冰冻切片的制备206

（一）石蜡切片和HE染色标本制备206

（二）冰冻切片标本制备209

实验二 DNA的Hoechst33258和DAPI荧光组织化学染色210

（一）DNA的Hoechst 33258荧光组织化学染色210

（二）DNA的DAPI荧光组织化学染色211

实验三 脂类的异丙醇油红○法染色212

实验四 钙-钴法显示碱性磷酸酶213

实验五 偶氮偶联法显示酸性磷酸酶214

实验六 胆碱酯酶染色——Kamovsky-Roo ts法215

实验七 还原型辅酶Ⅱ-黄递酶（NA DPH-d）染色216

实验八 免疫组织化学实验——SABC法217

实验九 免疫荧光细胞化学染色（间接法）219

实验十 半抗原标记cRNA探针原位杂交组织化学染色220

附录一 免疫组织化学染色常用试剂配制223

（一）固定液223

（二）缓冲液225

（三）常用消化液227

（四）显色液227

（五）黏附剂228

（六）封固剂229

（七）其他229

附录二 原位杂交试剂配制231