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第1章 流式细胞仪基本结构与原理1

1.1 流式细胞仪基本结构与功能1

1.1.1 流式细胞仪基本结构1

1.1.2 流式细胞仪的基本功能与应用4

1.2　流式细胞术的重要术语4

1.2.1 前向散射与侧向散射4

1.2.2　Coulter效应与电子体积6

1.2.3　荧光信号及其面积与宽度6

1.2.4 光谱重叠与荧光补偿7

1.2.5　细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间9

1.3 流式细胞术基本原理11

1.3.1　流式细胞术分析的基本原理11

1.3.2 流式细胞术分选的基本原理13

1.3.3 流式细胞仪荧光补偿设置14

1.4 流式细胞术的样本设置15

1.4.1　常用对照15

1.1.2　一套完整的流式细胞术检测样本设置16

1.5　流式细胞术的数据分析16

1.5.1　数据显示与分析17

1.5.2　设门20

1.5.3 数据分析中几种常见图形及分析原则23

第2章 抗原抗体反应基本特点与流式抗体及荧光染料的选择27

2.1　抗原抗体反应基本特点27

2.1.1　抗原抗体结合具有特异性27

2.1.2　抗原与抗体的结合是可逆的化学反应27

2.2　抗原抗体反应影响因素27

2.2.1 电解质27

2.2.2　反应温度与时间27

2.2.3　pH值28

2.3　流式抗体的选择28

2.3.1 尽量使用直标抗体28

2.3.2　注意流式抗体的应用级别28

2.3.3　抗体滴度或标记量的选择28

2.3.4　根据流式细胞仪的类型及荧光素的荧光光谱选择荧光抗体28

2.3.5　根据检测物（抗原）表达量选择荧光染料29

2.4　荧光染料特性及其应用30

2.4.1　抗体标记荧光染料特性及其应用30

2.4.2　核酸荧光染料的特性及其应用30

2.4.3 细胞膜及其他荧光探针的特性及其应用33

第3章　细胞表面分子的检测与分析36

3.1 流式细胞术在细胞表面分子的检测与分析中的应用36

3.1.1　免疫细胞及其亚群的检测与功能分析36

3.1.2 血液系统细胞表面标志的研究36

3.1.3　细胞群体及细胞表面标志变化的监测36

3.1.4　细胞表面标志构成性质的分析36

3.2　标本制备36

3.2.1 血液或骨髓标本的制备36

3.2.2 体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备36

3.2.3　贴壁细胞的制备37

3.2.4　组织标本的制备37

3.3　细胞表面分子免疫标记方法37

3.3.1　直接免疫荧光法37

3.3.2　间接免疫荧光法38

3.3.3　全血直接标记法39

3.3.4 直接与间接免疫荧光混合染色法40

3.4　常用的免疫细胞表面标志的检测与分析40

3.4.1 T淋巴细胞及其亚类检测41

3.4.2 B淋巴细胞及其亚类检测47

3.4.3 NK细胞与NKT细胞检测47

第4章 细胞内或细胞核内抗原检测与分析49

4.1 流式细胞术分析细胞内或细胞核内抗原基本步骤49

4.1.1 细胞固定剂和穿膜剂的选择49

4.1.2 最佳抗体浓度的选择51

4.1.3　细胞膜内外FcR的封闭51

4.2　胞内抗原的检测与分析——胞内细胞因子的检测与分析51

4.3 核内抗原的检测与分析——调节性T细胞（Treg,CD4+CD25+Foxp3+）的检测与分析56

第5章　细胞凋亡的检测与分析60

5.1　样品来源与收集60

5.2　PI单染法——亚“G1”峰检测法61

5.3 Annexin-V-PI复染法63

5.4　末端转移酶标记技术（TUNEL）65

5.5 细胞周期特异性细胞凋亡的检测（PI-Annexin-V,PA法）66

第6章 DNA含量检测与细胞周期的分析69

6.1 常用DNA和RNA染料70

6.2　DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义72

6.2.1 DNA倍体分析的判定标准72

6.2.2 DNA倍体分析在肿瘤诊断和治疗中的意义73

6.3 细胞DNA检测的内参考标准74

6.3.1　鸡红细胞74

6.3.2　人淋巴细胞74

6.3.3　鳖红细胞75

6.4 DNA样品的制备和检测75

6.4.1 DNA样品的制备和检测的影响因素与注意事项75

6.4.2 培养细胞或悬浮样品的DNA含量检测76

6.4.3 新鲜组织细胞核的DNA含量检测77

6.4.4 石蜡包埋组织块切片的DNA含量检测78

6.4.5　FCM在肿瘤脱落细胞学检查的应用78

6.5　数据采集后的软件分析79

6.5.1 运用ModFit LT进行自动分析80

6.5.2　运用ModFit LT进行手动分析80

6.5.3　运用ModFit进行同步化分析81

6.5.4 运用ModFit LT进行增殖分析82

6.6　药物对细胞周期的影响82

6.7　流式细胞核型分析83

6.8 FCM-DNA检测的质量控制85

6.8.1　标本采集和固定方法的质控85

6.8.2　单细胞悬液制备的质控制备85

6.8.3　石蜡包埋组织单细胞悬液制备的质控85

6.8.4　脱落细胞样品的采集86

6.8.5 细胞悬液荧光染色的质控86

6.8.6　流式细胞仪器操作技术质控86

6.8.7　流式细胞分析资料处理的质控86

6.8.8　定量荧光细胞染色技术的评价标准86

第7章 细胞增殖的检测与分析87

7.1 以检测细胞增殖抗原标志物为基础的分析法87

7.1.1 BrdU/DNA双参数法87

7.1.2 Ki-67检测与分析88

7.1.3 PCNA/DNA双参数法89

7.1.4 Cyclins/DNA双参数法90

7.2　以检测细胞分裂情况为基础的分析法92

7.2.1　检测细胞增殖的常用荧光染料及其分析原理92

7.2.2 以检测细胞分裂情况为基础的分析法的应用93

第8章　细胞毒的检测与分析98

8.1　体外细胞毒检测方法98

8.1.1 CFSE/PI或PKH-67/PI检测法98

8.1.2 GFP/PI检测法——以NK杀伤活性为例100

8.2 体内CTL细胞毒检测方法——CFSE标记法101

第9章 可溶性蛋白质分子的检测与分析103

9.1 可溶性蛋白质分子的定性、定量检测与分析103

9.2 可溶性蛋白质分子的定量检测与分析——液相芯片技术（LabMAPTM和CBA技术）104

9.2.1　液相芯片技术的基本原理104

9.2.2　液相芯片的技术优势104

9.2.3　液相芯片的主要实验步骤105

9.2.4 LabMAPTM技术105

9.2.5 BD微球阵列分析技术（CBA技术）105

第10章　报告基因的检测和分析109

10.1　报告基因GFP及其突变体109

10.2　报告基因GFP及其突变体在生物学中的应用110

10.2.1　筛选新的药物110

10.2.2　发育分子机理研究110

10.2.3 细胞筛选或分选标记物110

10.2.4 基因产物功能及基因定位研究110

10.2.5 细胞功能活动的动态观察110

10.2.6　细胞、分子之间的相互作用研究110

10.2.7　体内示踪与应用110

10.2.8　在RNA 干扰与核酶体研究中的应用110

10.2.9　免疫反应示踪标志物111

10.2.10　在细胞凋亡相关基因研究中的应用111

10.3　报告基因（GFP）的检测与分析111

10.3.1　报告基因转染效率和（或）GFP融合蛋白表达的检测与分析111

10.3.2 GFP融合基因的细胞周期检测与分析——GFP/PI双标记法111

10.3.3 在细胞凋亡相关基因研究中的应用——GFP/Annexin-V/PI三色标记法112

第11章 其他流式细胞术应用技术115

11.1 胞内活性氧水平的检测与分析115

11.1.1 DCFH-DA单染色法115

11.1.2 DCFH/PI染色法117

11.1.3 双氢罗丹明（Rhodamine）123染色法117

11.2　细胞膜电位的检测与分析119

11.2.1　检测细胞膜电位的染料及其检测原理119

11.2.2　Cyanine（花青苷）染色法120

11.2.3　罗丹明123染色法120

11.2.4　JC-I染色法120

11.3　细胞内钙离子浓度的检测与分析122

11.3.1　检测细胞内钙离子浓度的荧光探针与检测原理122

11.3.2　细胞内钙离子浓度的检测与分析——Fluo-3/AM染色法124

11.4　荧光共振能量转移技术及应用125

11.5 干细胞（SP）的检测——Hoechst33342法128

第12章 流式细胞仪的发展和商品化仪器130

12.1　流式细胞仪的发展历史和趋势130

12.1.1　专业化的流式细胞仪纷纷面世131

12.1.2　仪器全面自动化132

12.1.3 多色多参数分析迅速发展132

12.2　流式细胞仪商品仪器概述133

12.2.1 激发光源及其荧光染料133

12.2.2　液流系统137

12.2.3　信号检测和光电转换138

12.2.4　分选系统140

12.2.5　数据处理与分析141

12.2.6　流式微球芯片142

12.2.7　图像流式细胞仪143

12.3　流式细胞仪的主要技术指标144

12.3.1　荧光分辨率144

12.3.2　荧光灵敏度144

12.3.3　前向角散射光灵敏度145

12.3.4　前向角散射光分辨率145

12.3.5　分析速度145

12.3.6　分选指标145

附录1 常见流式细胞术及荧光显微镜荧光染料激发波长与发射波长快查表146

附录2149

2.1　常用溶液的配制149

2.2 Hanks液的配制149

2.3 磷酸盐缓冲液（PB）的配制150

参考文献153