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第1章 点样微阵列探针的生成1

导言1

方案4

1.cDNA克隆集的复制和储存4

附加方案：使用冷冻菌种8

2.来自细菌克隆集探针的PCR扩增9

可选方案：作为扩增模板的质粒DNA的制备16

3.PCR产物的纯化17

可选方案：用乙醇沉淀法纯化扩增产物18

4.PCR产物的观察和评估19

附加方案：用PicoGreen进行定量22

5.点样法阵列备用DNA的重新悬浮及储存23

6.从酵母中分离和扩增用于阵列的材料25

信息栏30

克隆集30

点样微阵列中使用的对照36

基因组和cDNA文库中T1噬菌体的预防和检测38

长链寡核苷酸的点样：替代用于表达分析的cDNA阵列42

酵母探针44

参考文献49

因特网资源51

第2章 玻璃微阵列的点样53

导言53

方案62

1.制备用于微阵列的聚L-赖氨酸玻片62

2.在玻片上点样64

3.检查印刷玻片的质量72

替代方案：利用标记的引物杂交75

4.鹅毛笔针的保养与清洗77

信息栏80

微阵列接触印刷使用的点样仪与点样针80

用于点样的基底86

参考文献89

因特网资源89

第3章 RNA的表达分析90

导言91

PARTⅠ RNA分离92

导言92

方案97

1.来自哺乳动物组织和细胞的总RNA的纯化97

替代方案：从OCT包埋的病理样品中提取RNA103

2.用FastPrep仪器从组织中分离总RNA105

3.用TRIzol从植物组织中分离总RNA106

4.松树方法分离植物RNA109

5.用FastTrack分离poly（A）＋RNA111

6.分离膜结合的多核糖体RNA115

7.用批量制备色谱法分离poly（A）＋RNA122

8.用CsCl溶液超速离心分离RNA124

9.酵母总RNA的纯化127

替代方案：用锁相胶纯化RNA130

10.E.coli RNA的纯化130

11.从单细胞和少量组织中分离和扩增RNA134

替代方案：组织切片中RNA的原位转录145

附加方案：切片的吖啶橙染色147

12.RNA通用参考集148

PARTⅡ 标记和杂交152

导言152

方案156

13.用反转录酶进行cDNA第一链的荧光标记156

替代方案：荧光标记的cDNA的纯化和浓缩（Microcon YM-30）163

14.用氨基-烯丙基染料对DNA进行间接荧光标记164

15.用于为筛选DNA微阵列筛选产生靶序列的mRNA制备物的扩增170

附加方案：标记aRNA178

16.用于表达分析的少量mRNA的扩增179

17.用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段标记第二链DNA188

替代方案：用E.coli DNA聚合酶的Klenow片段标记基因组DNA191

18.用生物素化核苷标记扩增RNA来与寡核苷酸阵列杂交192

附加方案：生物素化cRNA的片段化196

19.未掺入的Cy染料的回收：使用HPLC重新纯化197

20.杂交和杂交后洗涤201

附加方案：微阵列玻片的叠放211

疑难解答指南211

信息栏225

Alexa染料225

细菌微阵列226

用酚抽提蛋白质和DNA229

甲酰胺230

采用胍盐抽提RNA232

动物细胞及组织的匀浆233

抑制RNase234

哺乳动物、植物和细菌的RNA236

测量DNA染料标记的效率238

鼠白血病病毒反转录酶239

oligo-（dT）纤维素240

RNA的定量240

RNA操作的特别注意事项242

RNA的保存和回收243

参考文献244

因特网资源252

第4章 膜点样cDNA阵列253

导言253

PART Ⅰ 膜阵列的制备和杂交254

方案255

1.膜阵列的点样255

2.RNA的制备和标记258

3.靶分子与膜阵列的杂交260

附加方案：靶分子的清除和膜的重新利用262

PARTⅡ 数据的分析和解释264

参考文献265

因特网资源266

第5章 组织显微切割267

导言267

PART Ⅰ 徒手显微切割和激光俘获显微切割273

导言273

方案275

1.徒手显微切割275

替代方案：冰冻组织样品的显微切割278

2.激光俘获显微切割278

3.免疫-LCM283

4.应用于表达分析的显微切割组织的处理284

PARTⅡ 激光压力弹射288

导言288

方案294

5.准备载玻片用于为LMPC进行组织切片294

6.用于LMPC的石蜡包埋组织切片的制备295

7.用于LMPC的新鲜冰冻组织切片的制备297

8.使用Zincfix固定组织的LPC用于mRNA谱分析298

9.使用液体盖玻片保护组织样品301

10.激光显微切割和弹射后活细胞的分离302

参考文献306

因特网资源309

第6章 基因组微阵列分析310

导言311

PARTⅠ 微阵列检测DNA拷贝数311

导言311

方案314

1.cDNA微阵列比较基因组杂交314

2.制备BACDNA用于通过连接介导PCR进行CGH320

3.BAC基因组微阵列CGH330

4.基于微阵列的DNA拷贝数代表性分析：靶DNA制备335

5.基于微阵列的DNA拷贝数代表性分析：玻片制备及杂交342

PARTⅡ 突变检测及SNP基因分型347

导言347

方案349

6.SBE-标签阵列用于SNP基因分型349

替代方案：为SBE进行多重扩增反应364

7.Affymetrix标签阵列用于SBE SNP基因分型368

8.高密度微阵列用于序列变异检测376

9.SNP阵列用于杂合性缺失分析386

PARTⅢ 基于微阵列的DNA蛋白质相互作用检测：微阵列上的染色质免疫沉淀399

导言399

方案400

10.应用阵列对酵母基因组上DNA-蛋白质相互作用作图400

11.酵母基因组的DNA-蛋白质相互作用作图：DNA扩增及标记405

PARTⅣ SNP序列：作图数据409

表6-7多重引物集合：SNP作图数据409

表6-8 Affymetrix HuSNP芯片中的SNP在图谱上的位置409

参考文献448

因特网资源452

第7章 基因芯片生物信息学简介453

导言453

PARTⅠ 微阵列表达实验的设计456

PARTⅡ 图像分析468

PARTⅢ 标准化477

PARTⅣ 芯片数据的表示和评价485

PART Ⅴ LIMS、数据库和数据管理492

PARTⅥ聚类分析与显示508

PARTⅦ多维尺度法和自组织图520

信息栏528

基因注释528

在研究人员之间共享微阵列数据531

参考文献534

因特网资源538

第8章 组织微阵列540

导言540

方案543

1.制备组织微阵列543

附加方案：手工制备组织阵列548

2.应用组织阵列进行原位杂交551

3.组织阵列上的免疫组织化学565

替代方案：抗原去隐蔽和胰蛋白酶消化576

参考文献577

因特网资源579

附录580

附录1 构建全长基因文库580

附录2 试剂、缓冲液和培养基594

附录3 注意事项614

附录4 供应商620

DNA微阵列网站621

中文版索引622

原著索引627