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第一章 质粒的制备1

第一节 细菌的培养和保存1

一、培养基的制备1

二、液体细菌培养2

三、固体细菌培养2

四、菌种的保存与复苏2

第二节 细菌感受态的制备和质粒的转化2

一、感受态细胞的制备3

二、细菌的转化3

第三节 质粒的提取和纯化3

一、质粒的小量提取3

二、质粒的大量提取(碱裂解法)5

第二章 DNA的限制性内切酶酶切技术7

第一节 限制性内切酶的特性和反应条件7

一、限制性内切酶的来源7

二、限制性内切酶的命名7

三、分类7

四、限制酶的特性8

五、酶活力单位的定义及酶的贮存8

六、限制酶的反应条件8

第二节 限制性内切酶的应用方法11

一、小量酶解反应12

二、大量酶解反应12

三、双酶解反应12

四、酶解产物的鉴定13

第三章 DNA重组体的构建15

第一节 DNA重组的方法15

一、粘端连接法15

二、平端连接法17

三、平-粘连接法18

第二节 DNA重组反应19

一、粘端连接反应方法19

二、平端连接反应方法19

三、定向连接反应19

第三节 重组质粒的鉴定20

一、α互补20

二、插入失活21

三、菌落原位杂交21

四、限制酶酶切分析22

第四章 DNA序列测定24

第一节 Sanger双脱氧链终止法的原理及试剂24

一、原理24

二、试剂24

第三节 聚丙烯酰胺测序凝胶的制备25

一、测序板的处理与安装25

二、测序凝胶的灌制26

第三节 测序样品的制备反应与高压电泳26

一、应用T7测序试剂盒的测序反应方法26

二、引物末端标记法27

第四节 测序凝胶的放射自显影与序列的读取28

一、放射自显影28

二、DNA序列的读取28

第五章 核酸探针的制备和标记30

第一节 核酸探针的基本概念和种类30

一、基本概念30

二、探针的种类及选择30

三、各类标记物及选择30

第二节 DNA探针的制备和标记31

一、切口平移法31

二、随机引物法32

三、单链DNA探针的制备和标记34

四、DNA探针的末端标记36

第三节 RNA探针的制备和标记40

一、SP6/T7RNA聚合酶体外转录的原理40

二、RNA探针制备方法41

第四节 寡核苷酸探针的制备和标记42

第五节 探针的纯化和比放射性活性测定42

一、探针的纯化42

二、探针的比放射性活性测定44

第六节 非同位素法标记核酸探针44

一、地高辛标记法45

二、光敏生物素法46

第六章 DNA的凝胶电泳47

第一节 琼脂糖凝胶电泳47

一、琼脂糖凝胶的性质47

二、电泳装置48

三、电泳缓冲液48

四、凝胶浓度的选择48

五、常规琼脂糖凝胶电泳48

六、碱性琼脂糖凝胶电泳49

第二节 聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳50

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳50

二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳52

第三节 从凝胶中回收和纯化DNA53

一、DNA的回收53

二、回收DNA的纯化(DEAE-sephacel柱层析法)54

第七章 真核细胞总RNA的制备与分析56

第一节 RNA的制备56

一、培养细胞总RNA制备57

二、组织RNA的制备(并硫氰酰胍法)59

三、Poly(A)+RNA的纯化(寡聚(dT)纤维素纯化mRNA59

四、分级分离RNA60

第二节 RNA的分析62

一、Northern Blot杂交62

二、RNA的狭线杂交63

第八章 细胞及组织DNA的制备和Southern Blot分析65

第一节 真核基因组DNA的制备65

一、细胞基因组DNA的提取65

二、组织细胞基因组DNA的提取66

三、DNA的纯化、定量和浓缩67

第二节 DNA印迹转移杂交技术70

一、琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA限制性酶切片段70

二、DNA的转移与固定71

三、预杂交和杂交77

第三节 放射自显影和显色反应78

一、放射自显影78

二、非同位素探针杂交的检测79

第九章 克隆化基因的表达与蛋白产物的检测84

第一节 原核表达系统的理论基础84

一、原核细胞的分子生物学特点及表达调控因素84

二、外源基因的克隆与重组85

三、外源基因的蛋白表达方式85

第二节 克隆化基因产物的检测与分析86

一、外源基因的诱导表达86

二、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化86

三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术88

四、Western印迹法检测表达蛋白92

第十章 生长因子的常用检测方法95

第一节 生长因子的定性检测95

第二节 生长因子的定量检测96

一、免疫沉淀法检测表达蛋白96

二、ELISA法98

第三节 生长因子活性检测100

一、3H-TdR掺入法101

二、MTT比色法101

第十一章 聚合酶链反应技术103

第一节 PCR的原理与基本操作103

一、PCR的原理103

二、基本操作103

第二节 PCR反应体系中的各种组分104

一、引物104

二、DNA聚合酶106

三、PCR反应缓冲液106

四、dNTRs107

第三节 PCR反应模板的制备107

一、细菌DNA的制备107

二、全血标本DNA制备107

三、从白细胞中制备DNA108

四、临床拭子标本DNA的提取110

五、固定和包埋的组织标本DNA提取111

六、绒毛及羊水细胞DNA的提取112

七、由微量及特殊标本中制备染色体DNA112

八、DNA标本的制备112

第四节 PCR反应条件的优化113

一、温度循环参数113

二、PCR产物积累规律114

三、手工操作和自动化114

四、预防假阳性结果114

第五节 PCR扩增产物的分析115

一、凝胶电泳分析法115

二、点杂交116

三、微孔板杂交法118

四、PCR-ELISA法119

第六节 PCR相关技术及其应用119

一、PCR引物的5’端修饰119

二、应用PCR制备探针122

三、PCR克隆123

四、原位PCR124

五、逆转录PCR125

六、其它几种PCR相关技术126

第十二章 原位杂产技术128

第一节 原位杂交技术基础程序128

一、玻片的预处理128

二、组织取材与固定剂的选择130

三、组织切片的处理130

四、杂交反应131

五、杂交后处理133

六、杂交体的检测134

七、对照实验和ISHH结果的判断135

八、原位杂交基本操作步骤137

第二节 组织细胞原位杂交技术137

一、细胞和组织片制作137

二、预杂交和杂交138

三、杂交后处理138

四、显示系统139

第三节 染色体原位杂交技术141

一、染色体的制备141

二、原位杂交142

三、信号检测142

四、显带复制142

第四节 原位杂交结合免疫组织化学技术143

一、同位素原位杂交与免疫组化PAP法联合程序143

二、非同位素原位杂交与免疫组化联合法143

第五节 双重标记原位杂交技术145

一、两种同位素标记探针的双重标记原位杂交145

二、结合放射性同位素和非放射性标记探针的双重标记原位杂交145

三、非放射性标记探针的双重标记原位杂交146

第六节 电镜原位杂交技术147

第七节 PCR与原位杂交细胞化学结合法149

第八节 原位引物延伸标记法150

第十三章 真核细胞基因转染技术152

第一节 细胞培养基本技术152

一、培养基制备152

二、细胞冻存153

三、细胞复苏153

第二节 细胞转染方法153

一、转染质粒的制备153

二、磷酸钙介导转染法154

三、DEAE葡聚糖介导转染法155

四、电击基因导入法156

五、脂质体介导转染法157

第三节 转染细胞的筛选159

一、G418筛选160

二、克隆细胞株的转移与扩增161

第十四章 重组逆转录病毒的包装与克隆筛选163

第一节 重组逆转录病毒的包装163

一、包装细胞的来源与特性163

二、目的基因的导入与包装164

三、重组逆转录病毒液的制备164

四、病毒液的浓缩与保存165

第二节 病毒滴度的测定165

一、NIH3T3细胞的培养与准备165

二、病毒滴度测定与计算165

第三节 野生型病毒的检测166

一、PCR检测166

二、PT-PCR检测166

三、S+/L-检测法166

四、neo基因及β-半乳糖苷酪(β-gal)互补分析法166

第四节 逆转录病毒介导的体外基因转移方法167

一、靶细胞的选择条件167

二、常用靶细胞167

三、肿瘤浸润淋巴细胞的分离和培养168

四、病毒感染靶细胞168

第十五章 程序化细胞死亡常用研究方法170

第一节 基本概念170

一、PCD的形态学特征170

二、PCD的生化特性171

第二节 形态学观察方法172

一、普通光镜观察方法172

二、活细胞悬液荧光染色法174

三、透射电镜观察法175

附：超薄切片常规光镜观察制备方法175

第三节 琼脂糖凝胶电泳法176

一、常规法176

二、快速法177

第四节 流式细胞仪观察法177

一、PI染色法177

二、Hoechst-PI染色方法179

第五节 末端标记法180

一、简易末端标记法180

二、5’末端32P标记法181

三、原位末端标记法182

第十六章 分子生物学实验室常用仪器的使用方法与保养184

第一节 PCR扩增仪184

第二节 冷冻离心机185

第三节 紫外检测仪185

第四节 数字式酸度计186

第五节 分光光度计187

第六节 电泳仪188

第七节 分析天平189

附录一 常用实验用品的处理191

附录二 常用缓冲液和储存液的浓度及配制方法191

附录三 常用试剂的配制194

附录四 常用单位的换算195

附录五 常用的同位素及标记化合物196

附录六 放射性自显影试剂、器材及检测199

附录七 国内主要生物技术公司及试验仪器生产厂家200