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上篇 慢病毒分子生物学3

第一章 反转录病毒3

第一节 反转录病毒的分类与进化3

一、反转录病毒的分类3

二、反转录病毒的进化关系5

第二节 反转录病毒的结构6

一、病毒颗粒的超微结构6

二、病毒基因组的结构7

第三节 反转录病毒的生活周期9

一、反转录病毒的进入和脱衣壳9

二、反转录11

三、整合12

四、病毒RNA和蛋白质的合成及加工13

（一）病毒基因组RNA及mRNA的产生15

（二）病毒蛋白的合成及加工15

五、病毒颗粒的装配、释放和成熟18

第四节 反转录病毒基因表达与调控19

一、反转录病毒转录的启动子19

二、反转录病毒转录水平的调控20

三、转录后水平的调控20

四、翻译水平的调控21

五、翻译后水平的调控22

六、宿主抗反转录病毒因子22

第五节 反转录病毒引发的疾病23

一、复制型反转录病毒引起的疾病24

（一）插入激活导致的白血病24

（二）病毒致病性因子25

二、其他反转录病毒引起的疾病25

参考文献25

第二章 人免疫缺陷病毒及动物慢病毒概述31

第一节 人免疫缺陷病毒31

一、人免疫缺陷病毒的结构32

（一）毒粒结构32

（二）基因组结构33

（三）基因亚型34

二、人免疫缺陷病毒的生活周期35

三、人免疫缺陷病毒的嗜性和分类39

四、人免疫缺陷病毒的基因表达调控40

（一）HIV的启动子40

（二）HIV基因组RNA及mRNA的合成41

（三）HIV的调控蛋白Tat和Rev42

（四）HIV的辅助蛋白43

五、HIV-1感染与AIDS44

第二节 人免疫缺陷病毒复制适应性及其在母婴传播中的作用45

一、人免疫缺陷病毒母婴传播的流行及影响因素45

（一）人免疫缺陷病毒母婴传播流行趋势45

（二）人免疫缺陷病毒母婴传播途径46

（三）人免疫缺陷病毒母婴传播的影响因素48

二、人免疫缺陷病毒复制适应性在母婴传播中的作用49

（一）人免疫缺陷病毒复制适应性的概念及系统建立49

（二）人免疫缺陷病毒母婴传播病毒复制适应性靶细胞的选择及其应用51

（三）高病毒复制适应性是人免疫缺陷病毒母婴传播的固有特征且由包膜蛋白gp120 V1～V5决定52

三、人免疫缺陷病毒母婴传播存在选择性传播54

（一）传播病毒包膜蛋白gp120 V1～V5多样性及其糖基化位点数目具有选择性54

（二）传播病毒的复制适应性具有高选择性及选择性传播的可能机制56

第三节 动物慢病毒及牛免疫缺陷病毒57

一、动物慢病毒的进化58

二、动物慢病毒的致病性59

三、牛免疫缺陷病毒60

（一）牛免疫缺陷病毒的发现、培养特征和基因组结构60

（二）牛免疫缺陷病毒中国毒株BIV9204461

（三）牛免疫缺陷病毒变种Jembrana disease virus62

参考文献63

第三章 慢病毒的转录调控——Jembrana病毒反式激活因子的调控机制74

第一节 Jembrana病毒的分子生物学特征75

一、JDV的基因组结构75

二、JDV的长末端重复序列76

三、JDV的结构蛋白76

（一）Gag76

（二）Pol77

（三）Env77

四、JDV的非结构蛋白77

第二节 慢病毒Tat的反式激活作用78

一、HIV Tat的结构和功能78

二、Tat-TAR间的相互作用80

三、P-TEFb对RNA聚合酶Ⅱ转录的影响82

四、Tat与乙酰化酶的关系84

五、BIV Tat的反式激活85

第三节 JDV Tat功能域的精确划分86

一、jTat生物信息学分析86

（一）jTat的基本性质86

（二）jTat磷酸化修饰预测87

（三）jTat与bTat和hTat序列对比87

（四）JDV和BIV LTR同源性的比较87

（五）jTat反式激活能力的初步验证88

二、jTat核心域的界定88

（一）jTat核心功能域N端边界89

（二）jTat核心功能域C端边界90

（三）jTat激活域与结合域边界的划分91

三、jTat C端具有较强的RNA结合能力92

（一）hTat和bTat活性的验证92

（二）三种Tat间嵌合蛋白的构建93

（三）jTat结合域突变体的构建94

（四）嵌合蛋白及突变体的功能验证95

（五）JH没有活性与结合域完整性及细胞因子无关96

四、jTat激活时采用与hTat激活类似的细胞因子98

（一）jTat和hTat激活域对两种Tat活性具有抑制作用98

（二）过量T1和CDK9不能增强jTat激活能力99

（三）T1和CDK9反义转译质粒抑制jTat的激活能力100

五、jTat N端激活域能与细胞因子直接结合101

（一）jTat激活域具有独立的活性101

（二）真核双杂系统相关质粒构建102

（三）jTat激活域能与Cyclin T1相互作用105

（四）完整的jTat激活域是其与Cyclin T1相互作用的关键105

第四节 jTat激活域N端是其具有广泛活性的关键107

一、JB能激活JDV和HIV LTR107

二、jTat激活域能利用不同T1激活HIV LTR108

三、jTat活性受N端，而非C端融合蛋白的影响109

四、N端缺失1～15位氨基酸不影响jTat与T1的相互作用110

五、jN21-hTat能激活三种LTR111

（一）jTat N端与bTat和hTat融合蛋白的构建111

（二）jN21-hTat能激活三种LTR112

（三）jTat发挥多效性的可能作用模式112

第五节 jTat能直接穿膜并影响胞内基因表达113

一、Tat穿膜能力及其影响114

（一）关于HIV Tat穿膜的研究114

（二）与Tat类似的DNA/RNA结合多肽114

（三）寡聚精氨酸多肽链的穿膜能力115

（四）富含精氨酸多肽穿膜的可能机理116

（五）Tat穿膜作用对宿主的影响116

二、jTat具有直接穿膜的能力117

（一）EGFP-jTat能直接穿越质膜进入细胞117

（二）EGFP-jTat在细胞中的定位119

（三）EGFP-jTat的穿膜是时间和剂量依赖性的120

（四）EGFP-jTat穿膜是内吞和能量非依赖性的121

（五）精氨酸是jTat穿膜的关键氨基酸123

三、jTat影响胞内基因表达125

（一）胞外的jTat能激活胞内的JDV LTR125

（二）胞外jTat能激活胞内的NF-кB应答元件125

第六节 小结127

参考文献129

第四章 慢病毒复制——牛免疫缺陷病毒的微管依赖性运输137

第一节 病毒运输的重要轨道——微管137

一、细胞骨架概述138

二、微管的结构138

三、微管组织中心139

四、微管的极性140

五、微管动力学141

六、微管相关蛋白142

七、微管马达蛋白142

（一）马达蛋白概述142

（二）微管与细胞内物质运输143

（三）胞质动力蛋白的结构和功能143

（四）驱动蛋白的组成和功能145

（五）马达蛋白与病毒蛋白的相互作用146

第二节 几种典型病毒的运输147

一、HIV-1147

（一）HIV-1在感染早期的运输中与细胞骨架的相互作用147

（二）HIV-1在感染晚期的运输中与细胞骨架的相互作用149

二、人泡沫病毒150

三、牛痘病毒150

四、腺病毒Ⅱ型151

五、单纯疱疹病毒Ⅰ型151

第三节 微管和马达蛋白在BIV反向运输中的作用153

一、微管对BIV的感染具有重要作用153

（一）BIV指示细胞系的构建原理153

（二）BIV完成生活周期需要微管的参与154

（三）BIV感染的早期事件需要微管的参与155

二、BIV对微管动力学的调节157

（一）BIV感染保护微管不被解聚157

（二）BIV促进微管的稳定性158

三、BIV反向运输依赖于微管158

（一）BIV感染早期病毒颗粒的亚细胞定位158

（二）BIV的反向运输需要微管参与159

（三）微管是BIV反向运输的通道161

四、BIV反向运输依赖于dynein161

（一）BIV的感染需要dynein的功能161

（二）BIV的反向运输是由dynein介导的162

第四节 牛免疫缺陷病毒微管运输的分子机制164

一、BIV CA与dynein轻链亚基LC8存在相互作用164

（一）筛选病毒蛋白与dynein亚基的相互作用164

（二）CA与LC8在体内、体外和病毒感染中都存在相互作用165

（三）CA蛋白中LC8结合区域的界定167

二、LC8是介导BIV反向运输的关键168

（一）LC8对BIV的感染必不可少168

（二）BIV的反向运输需要LC8169

（三）LC8是连接病毒颗粒与微管和dynein的纽带170

三、病毒早期运输受阻会推迟病毒复制172

（一）微管药物可以使病毒复制推迟172

（二）LC8基因沉默使病毒复制严重推迟173

第五节 牛免疫缺陷病毒与其他病毒运输机制的比较175

一、BIV感染早期事件揭秘175

二、BIV反向运输的独特性176

（一）BIV感染早期对微管依赖性更强176

（二）BIV微管运输的效率不如HIV-1176

（三）BIV对微管具有独特的调节作用176

（四）不依赖于微管的病毒运输177

三、病毒蛋白与马达蛋白的相互作用177

（一）dynein是病毒反向运输的通用马达177

（二）病毒货物的多样性178

（三）结合LC8是偶然还是必然178

四、“以毒攻毒”的策略179

第六节 小结180

参考文献181

第五章 慢病毒与细胞凋亡——牛免疫缺陷病毒反式激活因子诱导细胞凋亡的分子机制187

第一节 病毒与细胞凋亡187

一、caspase家族和caspase信号通路187

二、微管与细胞凋亡189

三、病毒与细胞凋亡189

（一）病毒与细胞凋亡189

（二）HIV与细胞凋亡195

第二节 BIV感染引起细胞凋亡196

第三节 BTat和JTat蛋白引发细胞凋亡199

一、BTat蛋白引发细胞凋亡199

二、JTat蛋白诱导细胞凋亡202

三、BTat、JTat激活Caspase信号通路204

第四节 BTat、JTat影响微管的动力学206

一、BTat、JTat与微管蛋白及微管的相互作用206

二、BTat、JTat促进微管聚合210

三、BTat、JTat增加微管的稳定性212

第五节 Bim介导了JTat所引发的细胞凋亡213

一、JTat引发的细胞凋亡与JTat干扰微管动力学具有相关性213

二、JTat与其他微管相关蛋白及试剂在诱导凋亡上具有相似性214

三、Bim介导了JTat引发的细胞凋亡215

第六节 小结216

一、病毒与细胞凋亡217

二、BTat、JTat与细胞凋亡218

三、BTat、JTat与微管219

四、微管相关因子Bim介导了凋亡的发生219

参考文献220

第六章 慢病毒的潜伏机制——干扰素刺激基因产物bISG15与牛免疫缺陷病毒的潜伏感染224

第一节 干扰素刺激基因表达蛋白bISG15224

一、干扰素刺激基因表达蛋白225

二、牛干扰素刺激基因15蛋白——bISG15226

第二节 胎牛肺细胞（FBL）中bISG15的表达228

一、LPS和poly I:C可以提高FBL中bISG15的表达228

二、IRF-3参与poly I:C激活bISG15表达230

第三节 FBL中BIV与bISG15的相互影响234

一、BIV感染FBL可以刺激bISG15表达增加234

二、bISG15过表达可以抑制FBL中BIV的复制235

三、BIV的Tat可以抑制IRF-3对bISG15表达的激活237

四、bISG15在BIV潜伏感染中的可能作用238

第四节 BHV-1、BVDV感染FBL对bISG15表达的影响240

一、BVDV、BHV-1感染FBL抑制bISG15的表达240

二、BHV-1的早早期蛋白bICP0抑制IRF-3对bISG15表达的激活241

三、bISG15在BIV/BHV-1、BIV/BVDV超感染中的可能作用242

第五节 小结243

参考文献244

第七章 疱疹病毒超感染调节细胞信号通路激活慢病毒的复制246

第一节 HIV重要超感染病毒——疱疹病毒（herpesviruse）247

一、疱疹病毒247

二、单纯疱疹病毒249

（一）HSV的基因表达调控249

（二）HSV-1早早期调控蛋白ICP0250

（三）环指蛋白252

第二节 BHV-1早早期蛋白bICP0可激活BIV LTR的表达253

一、BHV-1超感染可以激活BIV基因表达253

二、BHV-1早早期蛋白bICP0可通过NF-кB细胞信号通路激活BIV LTR的表达255

第三节 bICP0和其环指结构域具有泛素连接酶E3活性257

一、泛素与泛素化修饰257

（一）催化泛素反应的酶257

（二）泛素化修饰在NF-кB细胞信号通路中的调节作用259

二、bICP0和其环指结构域具有泛素连接酶E3活性260

（一）bICP0能在体外催化多聚泛肽链的形成261

（二）bICP0功能域分析263

（三）bICP0在不同的E2存在下催化形成不同的多聚泛肽链型264

（四）bICP0能催化自身的泛素化反应265

第四节 ICP0/bICP0对NF-кB信号通路的调节267

一、NF-кB信号通路267

（一）NF-кB因子及其抑制蛋白IкB267

（二）NF-кB通路的激活269

二、病毒及其蛋白质对NF-кB通路的激活270

三、ICP0/bICP0对NF-кB信号通路的调节272

（一）bICP0激活BIV LTR需要其上潜在的NF-кB位点273

（二）ICP0/bICP0对NF-кB的激活需要其结构的完整275

（三）ICP0/bICP0能导致NF-кB因子的活化277

（四）ICP0/bICP0对NF-кB的激活与磷酸化无关280

（五）ICP0/bICP0对NF-кB的激活与泛素-蛋白酶体途径相关282

（六）ICP0/bICP0能通过泛素化IкBα方式激活NF-кB284

四、初步结论和尚未回答的科学问题288

（一）ICP0能通过直接泛素化IкBα而激活NF-кB信号通路288

（二）ICP0激活NF-кB通路的可能后果289

（三）尚未回答的问题291

第五节 ICP0/bICP0对AP-1信号通路的调节291

一、转录因子AP-1及AP-1通路的激活291

二、病毒及其蛋白质对AP-1通路的激活294

三、ICP0/bICP0对AP-1信号通路的调节294

（一）bICP0激活BIV LTR需要其上潜在的AP-1位点294

（二）ICP0对AP-1的激活可借助c-Jun磷酸化297

（三）ICP0对AP-1的激活与JNK相关298

（四）ICP0能提高JNK激酶的活性302

（五）ICP0对AP-1的激活需要完整的环指结构且与通路上游TAK1而非TRAF6相关304

（六）ICP0能与TAK1激酶相互作用并激活TAK1激酶，且这种激活需要ICP0环指结构域的完整性306

四、ICP0激活AP-1通路的可能后果307

第六节 小结309

参考文献312

第八章 慢病毒整合酶的结构——牛免疫缺陷病毒整合酶的结构生物学325

第一节 人免疫缺陷病毒的结构生物学研究325

一、包膜蛋白325

二、结构蛋白326

三、酶类328

（一）反转录酶328

（二）蛋白酶328

（三）整合酶329

四、调节蛋白329

（一）Tat329

（二）Rev331

（三）Nef331

（四）其他331

第二节 探索整合酶靶点的结构331

一、整合酶结构域的结构332

（一）N端结构域332

（二）催化核心结构域332

（三）C端结构域333

二、整合酶全长及包含两个结构域片段的结构生物学333

三、整合酶与药物结合机制的结构研究335

四、整合酶与宿主因子LEDGF的结构研究336

五、有待解决的问题337

第三节 BIV整合酶的结构生物学研究337

一、BIV整合酶结构域的预测338

二、BIV整合酶核心结构域的结构生物学研究338

（一）BIV整合酶核心结构域的可溶性表达、纯化及分子筛层析338

（二）BIV整合酶核心结构域晶体的生长和衍射340

（三）BIV整合酶核心结构域结构的解析341

（四）BIV整合酶核心结构域的晶体结构342

（五）两种晶体结构的比较343

（六）从新的BCCD二聚体晶体结构探究整合酶-宿主DNA相互作用机理344

第四节 小结346

参考文献347

第九章 基于牛免疫缺陷病毒的抗AIDS药物筛选体系的建立352

第一节 抗AIDS药物研究进展352

一、抗AIDS药物的发展历程352

二、抗AIDS药物的主要靶点355

（一）进入靶点355

（二）反转录酶靶点355

（三）整合酶靶点356

（四）蛋白酶靶点357

（五）成熟靶点358

三、耐药359

（一）耐药现象359

（二）耐药机理359

（三）耐药的分析方法360

四、抗AIDS药物的筛选360

（一）分子水平的筛选方法360

（二）细胞水平的筛选方法361

第二节 应用牛免疫缺陷病毒进行抗AIDS药物筛选364

一、应用BIV筛选抗AIDS药物的可行性分析364

（一）与HIV抗病毒靶位比较364

（二）建立基于BIV的抗艾滋病药物高通量筛选模型的可行性365

（三）小动物模型——BIV-兔模型366

二、建立BIV指示细胞系366

（一）BHK-21是BIV的许可细胞系366

（二）以绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系的建立368

（三）以萤火虫萤光素酶为报告基因的BIV指示细胞系的建立371

三、基于BIV指示细胞系筛选模型的建立374

（一）建立稳定的病毒储液374

（二）基于BIV指示细胞系的筛选方法375

（三）BIV高通量筛选体系的评估375

（四）BIV筛选模型的药物靶位分析376

四、BIV应用于抗AIDS药物高通量筛选的优势378

（一）定量检测方法——指示细胞系378

（二）稳定的病毒储液379

（三）高通量的检测和分析手段379

第三节 复筛体系的建立379

一、正对照药物的检测380

二、HIV-1假病毒检测体系符合高通量筛选要求380

第四节 小结381

参考文献382

第十章 BHIV cDNA的构建及其生物学活性389

第一节 BHIV嵌合病毒389

一、嵌合病毒的生物学意义及应用389

二、BIV与HIV基因组结构和功能的比较391

（一）BIV与HIV在进化上的亲缘关系391

（二）BIV与HIV的基因组结构比较392

（三）BIV与HIV结构基因的同源性比较393

（四）BIV与HIV基因功能的相关性393

（五）BIV与HIV在感染和致病方面的差异394

三、BHIV在AIDS疫苗研发中的意义394

第二节 互换结构基因的BHIV嵌合病毒395

一、BIV127 cDNA在人源细胞MT-4中的活性检测395

（一）BIV127 cDNA转染MT-4细胞后可以表达出多种病毒蛋白395

（二）BIV127 cDNA转染MT-4细胞后不能形成有感染性的病毒颗粒396

二、互换结构基因的BHIV cDNA的构建及活性396

（一）以HIV为主体的Bgag HIV和以BIV为主体的BHenv IV cDNA的设计396

（二）Bgag HIV和BHenv IV的生物学活性398

三、结果分析399

第三节 用BIV非结构基因取代HIV非结构基因的BHIV嵌合病毒401

一、替换非结构基因的BHIV cDNA的构建401

二、嵌合克隆Bvif HIV、Btat HIV和BLRTtat HIV在人源细胞中的生物学活性402

（一）Bvif HIV、Btat HIV和BLRtat HIV在人源细胞中的转录402

（二）蛋白质水平检测嵌合病毒Bvif HIV、Btat HIV和BLRTtat HIV cDNA在人源细胞中的表达402

（三）Btat HIV可以产生有感染性的病毒404

（四）显微镜下观察感染传代细胞的形态学改变405

（五）电镜检测病毒颗粒的形成406

三、结果分析406

（一）3种嵌合克隆转染人源细胞均有表达活性406

（二）嵌合克隆Bvif HIV cDNA在H9细胞中不能产生感染性病毒的原因406

（三）BIV Tat可以取代HIV-1 Tat，产生具有生物学活性的嵌合病毒Btat HIV407

（四）在MT-4细胞中，BIV Tat与BIV LTR的相互作用不能产生感染性病毒409

第四节 引入CMV启动子的BHIV嵌合病毒410

一、引入CMV启动子的BHIV cDNA的构建410

二、pc3G1、pc3G2、pc3G3和pc3G5嵌合病毒cDNA在人源细胞中的生物学活性411

（一）4个嵌合病毒cDNA的早期基因和晚期基因都能转录及正确剪切411

（二）4个嵌合病毒的晚期基因都能正常翻译412

三、病毒颗粒的检测412

（一）4种嵌合病毒都能在293T细胞中包装出病毒颗粒412

（二）病毒颗粒的核心蛋白没有完全剪切，病毒颗粒处于前成熟状态413

（三）病毒颗粒都包含反转录酶活性，但是pc3G1的反转录酶活性明显低于其他3个414

（四）嵌合病毒都含有基因组RNA415

四、病毒颗粒感染MT-4细胞实验416

（一）嵌合病毒颗粒能够吸附并进入MT-4细胞416

（二）pc3G3能在MT-4细胞中完成反转录过程416

（三）未能在MT-4细胞中检测到整合的病毒基因组DNA，也未能检测到病毒的子代RNA416

五、长期传代实验和免疫小鼠实验417

（一）实验组小鼠中都能检测到病毒特异性的抗体，但是滴度不高417

（二）实验组和正对照组均未检测到显著的病毒特异性CTL反应417

六、结果分析418

（一）嵌合病毒基因产物的表达和装配情况418

（二）BIV p3在嵌合病毒装配中发挥了重要的作用419

（三）HIV-1蛋白酶对BIV底物剪切的低效率是导致嵌合病毒颗粒处于前成熟状态的直接原因419

（四）HIV-1蛋白酶对BIV底物剪切的特异性与保守性分析419

（五）HIV-1蛋白酶对嵌合Gag蛋白位点的切割顺序和效率421

（六）BIV NC对HIV-1包装信号的识别及嵌合病毒基因组RNA的装配421

（七）BHIV嵌合病毒未能持续传代的可能原因分析422

第五节 小结423

参考文献424

第十一章 携带中国CRF07_BC HIV-1毒株env基因的SHIV嵌合病毒428

第一节 AIDS疫苗研究概况428

一、艾滋病疫苗研发资源428

二、我国的艾滋病疫苗研究429

第二节 AIDS疫苗评价的动物模型430

一、SIV研究概况及其与HIV的比较431

（一）SIV的研究概况431

（二）SIV和HIV的相同点432

（三）SIV和HIV的不同点433

二、AIDS疫苗评价的动物模型433

（一）HIV疫苗研制需要合适的动物模型433

（二）SHIV的构建及特征433

（三）SHIV在AIDS疫苗研究中的应用434

三、SHIV的研究进展436

第三节 中国株SHIV感染性克隆的构建436

一、重组SHIV克隆的构建策略及基因组结构437

（一）B亚型致病性SHIV-KB9分子克隆439

（二）三株中国SHIV感染性克隆的基因组结构439

二、外源基因的获得441

三、全长SHIV克隆的构建、筛选和鉴定442

（一）携带中国HIV-1 env基因的半长SHIV克隆的筛选442

（二）携带不同HIV-1基因的SHIV全长克隆的构建和筛选442

（三）具有感染能力的SHIV克隆株的筛选444

（四）三株SHIV克隆的背景资料和亚型分类445

第四节 中国株SHIV感染性克隆细胞水平活性分析446

一、SHIV病毒颗粒的电镜观察446

二、SHIV的细胞嗜性检测448

三、SHIV在恒河猴PBMC中的细胞病变观察450

四、SHIV在人淋巴细胞中感染活性的比较451

五、DNA PCR检测SHIV在人PBMC细胞中的整合451

六、多株SHIV在恒河猴CD4+T淋巴细胞中感染活性的比较452

第五节 中国株SHIV感染性克隆在中国源恒河猴体内的感染活性454

一、SHIV-XJ02170的恒河猴感染和传代实验454

（一）在中国恒河猴体内的传代过程454

（二）SHIV-XJ02170传代后外周血CD3、CD4、CD8流式分析454

（三）SHIV-XJ02170病毒载量检测455

（四）SHIV-XJ02170病毒传代后全血cDNA PCR分析456

（五）SHIV-XJ02170传代后血浆结合抗体阳转时间分析456

二、SHIV-CN97001的恒河猴感染和传代实验457

（一）SHIV-CN97001在中国恒河猴体内传代过程及传代病毒RNA载量分析457

（二）SHIV-CN97001感染后病毒cDNA PCR鉴定458

三、SHIV-XJDC6431的恒河猴感染和传代实验459

（一）血浆病毒RNA载量检测459

（二）CD4细胞计数和CD4/CD8值分析460

（三）SHIV-XJDC6431感染后病毒的cDNA PCR鉴定461

（四）血清中HIV-1特异性结合抗体检测462

（五）SHV-XJDC6431在猴体内的传代实验462

第六节 小结463

一、无奈选择——人造病毒SHIV464

（一）具有代表性的SHIV的总结464

（二）SHIV嵌合病毒在恒河猴模型中的应用467

二、获得感染性SHIV嵌合病毒成功的关键470

（一）SHIV骨架及HIV-1外源片段的选择471

（二）恒河猴种属差异及病毒-宿主关系471

（三）病毒在体内的适应过程——通过猴体传代得到致病株472

三、展望472

参考文献473

下篇 泡沫病毒分子生物学479

第十二章 泡沫病毒概述479

第一节 泡沫病毒的复制479

一、病毒颗粒的超微结构480

二、泡沫病毒基因组481

三、泡沫病毒的复制特点482

（一）反转录482

（二）整合483

四、与正反转录病毒、嗜肝DNA病毒复制策略的比较484

第二节 泡沫病毒的基因表达调控485

一、泡沫病毒的启动子485

（一）泡沫病毒5'LTR启动子485

（二）泡沫病毒的内部启动子486

二、亚基因组转录物487

（一）来源于内部启动子的剪接转录物487

（二）源于5'LTR的gag、pol和env的剪切转录物487

（三）源于5'LTR的bel剪接转录物488

三、FV基因表达的转录后调控488

四、泡沫病毒的结构蛋白489

（一）Gag蛋白489

（二）Pol蛋白489

（三）Env蛋白490

五、泡沫病毒的调控蛋白491

六、FV其他基因产物在FV基因表达调控中的作用493

七、泡沫病毒介导的细胞基因表达的变化494

八、LTR和IP指导的基因表达的调控494

第三节 泡沫病毒Gag和Pol蛋白的翻译后加工495

一、病毒和细胞内天冬氨酸蛋白酶496

二、泡沫病毒的蛋白酶496

三、Gag和Pol蛋白的水解加工过程497

（一）Gag水解加工497

（二）Pol的加工剪切498

四、FV PR的调控498

第四节 病毒颗粒的装配和基因组包装498

一、病毒颗粒的装配498

二、Pol合成和组装500

（一）泡沫病毒的Pol合成500

（二）泡沫病毒的Pol包装500

三、RNA基因组包装500

（一）泡沫病毒的顺式作用序列500

（二）泡沫病毒的反式作用元件501

第五节 泡沫病毒包膜糖蛋白501

一、泡沫病毒包膜糖蛋白的特点501

二、包膜糖蛋白介导的膜融合502

三、包膜糖蛋白与泡沫病毒颗粒的释放502

第六节 泡沫病毒载体504

一、泡沫病毒载体的优势504

二、泡沫病毒载体系统506

（一）可复制的泡沫病毒载体506

（二）复制缺陷型载体507

（三）产生高滴度的病毒储液507

三、顺式作用元件508

四、包装细胞系509

第七节 灵长类泡沫病毒509

一、非人类灵长类泡沫病毒的系统进化509

二、灵长类泡沫病毒在细胞培养中的宿主范围511

三、灵长类泡沫病毒感染与免疫511

四、灵长类泡沫病毒感染的低等动物模型511

五、泡沫病毒对人的感染512

第八节 非灵长类动物泡沫病毒513

一、几种重要的非灵长类动物泡沫病毒513

（一）牛泡沫病毒513

（二）猫泡沫病毒513

（三）马泡沫病毒513

二、非灵长类动物泡沫病毒的分子生物学特征514

（一）gag基因514

（二）pol基因514

（三）env基因515

（四）辅助基因（调节基因）515

参考文献516

第十三章 牛泡沫病毒中国毒株BFV3026的分子生物学526

第一节 牛泡沫病毒中国株的分子生物学鉴定526

一、反转录酶活性检测527

二、Southern blot确证3026属于BFV527

三、3026病毒株基因片段的克隆及鉴定528

（一）PCR扩增及杂交528

（二）序列分析528

第二节 BFV3026的宿主范围及培养特性529

一、BFV3026的宿主范围529

二、BFV3026可使细胞发生强烈病变529

三、BFV3026可在部分细胞中建立持续性感染530

四、BFV3026的培养特性531

五、BFV与宿主相互关系浅析531

（一）兔子对BFV3026的感染产生持续性高水平免疫应答531

（二）BFV3026在兔子白细胞中运行的正常生活周期532

（三）BFV3026可侵染兔子的多种脏器533

第三节 BFV3026感染性克隆534

一、pBS-BFV的感染性测定534

（一）pBS-BFV可诱使细胞发生病变534

（二）pBS-BFV能行使正常转录功能535

（三）pBS-BFV可表达病毒所需蛋白质536

（四）pBS-BFV转染细胞可产生病毒颗粒536

二、BFV3026基因组序列分析537

（一）序列测定与比较537

（二）蛋白质二级结构比对540

第四节 BFV3026包装和出芽的相关研究541

一、包装细胞系的建立542

（一）pBS-FV对BL12细胞感染性测定542

（二）Gag-Pol及Env表达质粒的构建542

（三）包装细胞克隆的分离542

（四）包装功能测定543

二、转移顺式调控元件544

（一）BFV介导的基因转移依赖两个顺式元件的存在544

（二）CASⅠ、CASⅡ对于BFV3026介导的基因转移同等重要546

（三）BFV3026 CASⅠ对BFV蛋白表达的影响547

三、BFV3026衣壳的组装和出芽的机制550

（一）质粒构建和功能分析550

（二）BFV3026的组装和出芽552

第五节 BFV基因组RNA的二聚化554

一、体外二聚化条件的确立554

（一）二聚化的形成依赖一定的盐浓度554

（二）温度对二聚化形成的影响555

（三）BFV3026 1567nt RNA二聚体的热稳定性555

（四）二聚化的动力学研究556

二、BFV3026基因组RNA二聚化位点的界定557

（一）初步界定557

（二）精细定位558

第六节 BFV3026的反式激活因子对两类启动子的激活559

一、BTas蛋白是BFV的反式激活因子559

（一）BFV3026编码自身的反式激活因子559

（二）BFV3026编码249个氨基酸的BTas蛋白即为自身的反式激活因子559

二、BTas蛋白在BFV LTR上的应答元件（TRE）560

（一）位于U3的-983/-668（TREⅠ）和-470/-140（TREⅡ）两区段是BTas蛋白的正调控元件560

（二）TREⅡ类似增强子元件561

（三）BFV LTR TREⅡ的进一步界定562

三、BFV LTR RU5区的负调控作用566

四、BFV env基因3′端编码一个内部启动子567

（一）BFV内部启动子的克隆567

（二）克隆片段的序列分析567

（三）克隆片段的功能分析568

（四）不同病毒内部启动子同源性比较568

（五）完整的BFV IP位于BFV基因组9117～9405之间570

（六）BTas蛋白的应答元件（TREIP）位于9205～9276的72bp区段572

（七）TREIP具有典型的增强子特点573

（八）Tas对IP的激活作用必须有TATA盒的参与574

（九）BFV ORF-1蛋白是IP起始基因表达唯一所需的病毒辅助蛋白575

（十）BFV Tas蛋白与TREIP的相互作用576

五、BTas蛋白对BFV LTR和IP激活作用的比较577

（一）BFV LTR和IP基础活性的比较577

（二）BTas蛋白对BFV LTR和IP激活活性的比较578

六、BFV和BIV共感染过程中的相互作用579

（一）BFV3026对BIV LTR整体水平上的激活作用579

（二）BFV的反式激活因子BTas对BIV LTR的激活作用580

（三）BTas与Tat协同激活BIV LTR起始基因表达580

（四）BIV对BFV LTR的激活作用581

第七节 指示细胞系的建立582

一、BICL细胞系的构建582

（一）细胞转染及G418初筛582

（二）单克隆化582

（三）指示细胞系的初步鉴定583

（四）指示细胞系与CPE方法的比较583

（五）两种感染方法滴度比较584

（六）指示细胞系对于不产生CPE的病毒感染的检测585

（七）指示细胞系用于检测BFV的体外宿主细胞范围587

（八）利用指示细胞系检测BFV的复制策略588

二、BFVL细胞系的构建589

（一）BFVL指示细胞系的构建589

（二）BFVL指示细胞系响应BFV感染的特异性590

（三）BFVL指示细胞系响应BFV感染的敏感性591

（四）BFVL指示细胞系对不同感染滴度的BFV的响应591

（五）BFVL指示细胞系的萤光素酶活性表达与BFV滴度的相关性592

第八节 BFV3026的反式激活因子BTas的功能593

一、BTas的亚细胞定位593

二、BTas转录物的研究594

（一）BTas转录物的确定594

（二）BFV感染细胞btas特异性转录物的动力学变化596

（三）btas 4种转录物功能检测597

三、BTas的结构域的确定601

（一）DNA结合结构域601

（二）激活结构域的界定602

四、BTas的二聚化604

（一）BTas能够在体内和体外形成多聚复合物604

（二）BTas能够在哺乳动物细胞核内形成二聚体605

（三）确定BTas的二聚化位点606

（四）BTas的核定位并不需要BTas的二聚化607

（五）BTas与BFV LTR和IP的结合不需要BTas的二聚化608

（六）BTas的转录激活活性依赖于BTas的二聚化610

第九节 小结611

参考文献611

第十四章 牛泡沫病毒通过活化细胞NF-кB信号通路促进其转录及复制613

第一节 病毒与NF-кB信号通路613

一、病毒激活NF-кB信号通路的机制614

（一）HIV-1激活NF-кB信号通路614

（二）HTLV-1激活NF-кB信号通路615

（三）疱疹病毒激活NF-кB信号通路615

（四）嗜肝病毒激活NF-кB信号通路615

二、NF-кB信号通路对于病毒复制的多效性616

三、病毒通过NF-кB信号通路控制凋亡617

四、病毒通过NF-кB信号通路促进细胞转化617

第二节 BFV激活细胞内NF-кB信号通路617

一、BFV感染激活细胞内NF-кB信号通路617

二、BTas激活细胞NF-кB信号通路620

三、BTas激活细胞NF-кB信号通路的特异性621

四、BTas激活细胞NF-кB信号通路的分子机制621

（一）BTas激活细胞NF-кB信号通路需要其结构的完整性621

（二）BFV及BTas通过引起IкBα磷酸化激活NF-кB信号通路621

（三）BTas引起的IкBα磷酸化及NF-кB激活需要活化IKKβ623

（四）BTas能够引起p100的剪切624

（五）BTas与IKKα和IKKβ相互作用625

第三节 NF-кB的活化增强BFV的转录627

一、NF-кB的活化增强BTas介导的LTR的转录627

二、BFV LTR是不含кB位点的启动子628

第四节 BFV通过NF-кB增强其转录的机制629

一、BTas与RelB相互作用629

（一）BTas与RelB相互作用的确证629

（二）BTas与RelB相互作用区域的确定632

二、RelB促进BFV的转录及复制634

（一）RelB增强BTas介导的BFV LTR的转录634

（二）RelB增强BTas介导的LTR转录的特异性634

（三）细胞内源RelB蛋白参与BTas介导的LTR转录636

（四）RelB促进BFV的复制638

三、RelB增强BTas介导的LTR转录的分子机制638

（一）RelB增强BTas介导的LTR转录依赖于其与BTas的相互作用638

（二）RelB的核定位对于其增强BTas介导的LTR转录也是必需的639

（三）RelB的TAD对于其增强BTas介导的LTR转录也是必要的640

（四）RelB增强BTas介导的LTR转录需要LTR上的元件641

（五）BFV复制过程中RelB蛋白存在于病毒LTR的转录复合物之中643

四、BFV感染通过其反式激活因子BTas增强细胞内RelB的转录644

第五节 小结646

参考文献648

第十五章 宿主因子对泡沫病毒的转录调控651

第一节 Enolase对BFV转录的调控作用652

一、Enolase蛋白其他功能653

二、α-Enolase对PFV启动子的转录调控机制653

（一）Enolase结合区域界定654

（二）Bell结合区域界定654

（三）Enolase对PFV转录启动子的抑制作用655

第二节 AP-1激活BFV IP转录调控657

一、AP-1的生物学特性及功能658

（一）AP-1的组成和生化特性658

（二）AP-1转录因子参与不同的生化途径658

（三）TPA:AP-1的激活因子659

二、AP-1激活BFV IP660

（一）TPA激活BFV IP660

（二）AP-1激活BFV IP661

（三）c-Jun突变体抑制TPA对BFV IP的激活662

（四）AP-1激活BFV IP系列缺失体研究662

（五）BFV IP中AP-1应答元件点突变研究663

（六）AP-1应答元件的EMSA实验664

（七）TPA和AP-1促进病毒蛋白BTas表达668

（八）TPA和AP-1能够提高病毒的复制水平668

第三节 小结669

一、宿主对泡沫病毒的防御670

二、AP-1与泡沫病毒的时序调控模型670

参考文献673

第十六章 干扰素诱导蛋白IFP35通过与泡沫病毒调控蛋白相互作用抑制病毒的复制678

第一节 泡沫病毒与干扰素研究进展678

一、干扰素的性质和作用678

二、病毒感染与IFN系统679

（一）IFN-α/β产生的诱导机制679

（二）IFN-α/β经典信号传导途径680

（三）干扰素诱导的抗病毒活性681

（四）病毒拮抗干扰素的作用683

三、干扰素抗泡沫病毒的研究进展685

四、干扰素诱导蛋白PML抗泡沫病毒的研究进展686

第二节 Tetherin抗原型泡沫病毒的机制686

一、Tetherin的研究现状688

（一）Tetherin简介688

（二）Tetherin的抗病毒作用688

二、Tetherin抑制PFV释放的机制692

（一）Tetherin抑制PFV的释放692

（二）Tetherin的跨膜区和GPI锚定区对抑制PFV的释放至关重要693

（三）Tetherin的二聚化和糖基化作用对其抑制PFV释放的功能的影响693

（四）不同种属的Tetherin对PFV的抑制作用695

第三节 IFP35抗泡沫病毒的机制探讨696

一、IFP35简介697

二、IFP35抗泡沫病毒的机制697

（一）确证BTas与IFP35的相互作用697

（二）在293T细胞中过表达IFP35能够抑制BFV的感染700

（三）在HeLa细胞中过表达IFP35不能够抑制BFV的感染701

（四）BTas和IFP35的定位702

（五）IFP35抑制BTas介导的BFV LTR的反式激活作用703

（六）IFP35不能抑制BTas介导的BFV IP的反式激活作用705

（七）IFP35的抑制作用不依赖于AP-1和NF-кB信号通路705

（八）通过RNAi敲除内源性IFP35的表达能增加BTas介导的BFV LTR的激活作用706

（九）IFP35不能抑制BTas结合于BFV LTR709

（十）IFP35对PFV的作用710

第四节 Nmi抗牛泡沫病毒的机制713

一、Nmi与IFP35713

二、Nmi抗BFV的机制714

（一）过表达Nmi能够抑制BFV的感染714

（二）通过RNAi降低内源性Nmi的表达能增强BFV的复制715

（三）Nmi抑制BTas介导的BFV LTR和IP的反式激活作用717

（四）确证BTas与Nmi的相互作用719

（五）BTas与Nmi的相互作用是Nmi行使抑制功能所必需的721

（六）BTas和Nmi的定位723

第五节 小结724

参考文献725

第十七章 microRNA调控泡沫病毒的转录与复制734

第一节 microRNA的生物学特征734

一、microRNA的产生734

二、microRNA的生物合成735

（一）microRNA的转录调控735

（二）microRNA的成熟与加工735

三、microRNA对靶位点的识别规律736

第二节 microRNA与病毒感染737

一、宿主microRNA影响病毒的复制737

二、病毒microRNA影响病毒自身的复制738

三、病毒microRNA对宿主细胞的影响739

四、病毒通过调节宿主microRNA影响宿主基因的功能739

五、RNA病毒是否可以产生miRNA740

第三节 寻找靶向泡沫病毒PFV tas基因的宿主microRNA740

一、病毒PFV受宿主细胞microRNA的调控741

二、计算机软件的分析预测742

三、报告基因与表达质粒构建742

第四节 has-miR-491-5p的表达谱检测744

一、poly(A)qRT-PCR检测microRNA表达的原理744

二、用poly(A)qRT-PCR检测has-miR-491-5p的表达745

（一）检测has-miR-491-5p瞬式表达745

（二）检测has-miR-491-5p在细胞系及人组织中的表达746

三、miRNAmap数据库分析结果746

第五节 has-miR-491-5p对靶位点的识别与抑制作用747

一、has-miR-491-5p可显著抑制pEGFP-C1-T491的表达747

二、has-miR-491-5p对pEGFP-C1-T491表达抑制的特异性749

（一）瞬时转染p19对has-miR-491-5p介导基因表达抑制的解救749

（二）p19稳定表达细胞系可阻止has-miR-491-5p介导基因表达抑制749

（三）特异性单链核酸抑制剂可解救has-miR-491-5p介导的基因表达抑制749

三、has-miR-491-5p在mRNA水平抑制靶基因的表达750

第六节 has-miR-491-5p对PFV复制及基因表达的影响752

一、has-miR-491-5p有效抑制PFV Tas介导的转录激活752

二、has-miR-491-5p可显著抑制病毒的滴度753

三、has-miR-491-5p抑制PFV的复制及病毒蛋白的合成754

（一）has-miR-491-5p可显著抑制PFV基因组的复制754

（二）has-miR-491-5p可显著抑制PFV tas基因的表达756

（三）has-miR-491-5p可显著抑制PFV Gag基因的表达756

四、初步结论和尚未回答的科学问题756

第七节 小结756

参考文献758

第十八章 牛泡沫病毒反式激活因子乙酰化调控的分子机制762

第一节 蛋白质的乙酰化修饰762

一、染色质与转录激活762

二、乙酰化蛋白质的多样性及功能764

三、HAT家族765

（一）GNAT超家族766

（二）p300/CBP家族767

（三）MYST家族768

第二节 病毒复制与乙酰化调控769

一、HIV-1反式激活因子Tat的乙酰化调控机制770

（一）Tat功能与乙酰化相关的发现771

（二）Tat的乙酰化及其作用机制771

（三）Tat与组蛋白乙酰化773

（四）Tat通过乙酰化影响与宿主相互作用773

（五）HIV-1与乙酰化的其他研究774

二、HTLV-1反式激活因子Tax的乙酰化调控机制774

（一）HAT与Tax的相互作用775

（二）Tax抑制p53功能776

（三）HAT参与HTLV-1染色质重构776

（四）Tax的乙酰化修饰777

三、PFV反式激活因子Tas的乙酰化调控机制777

第三节 牛泡沫病毒反式激活因子BTas的乙酰化调控机制777

一、乙酰化途径参与BFV启动子的反式激活777

二、p300在体内和体外乙酰化BTas779

三、鉴定p300乙酰化BTas的底物赖氨酸780

四、p300调控BTas介导的反式激活水平781

五、乙酰化赖氨酸与BTas的细胞定位无关781

六、BTas的乙酰化增强其DNA结合能力782

七、乙酰化赖氨酸对BTas的DNA结合能力是重要的784

第四节 小结784

参考文献785

索引790

后记795