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序11

序21

译者的话1

前言1

第一章 脱氧核糖核酸（DNA）1

第一节 电泳1

一、琼脂糖凝胶电泳1

二、脉冲场凝胶电泳（PFGE）4

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）9

四、变性梯度凝胶电泳（DGGE）11

五、双向琼脂糖凝胶电泳16

第二节 DNA定量分析21

第三节 载体23

一、质粒载体23

二、酵母载体26

（一）裂殖酵母载体26

（二）酵母人工染色体（YAC）载体31

三、逆转录病毒载体和基因转移34

第四节 DNA克隆44

一、载体的选择44

（一）常用质粒载体44

（二）特殊用途的质粒载体45

二、PCR产物的TA克隆46

三、基因组DNA文库的构建49

四、DNA文库的筛选57

五、cDNA杂交选择60

六、应用PCR技术快速筛选克隆72

第五节 DNA转化与转染74

一、质粒DNA转化入细菌74

（一）利用TSS缓冲液转化大肠杆菌74

（二）用快速冷冻法转化大肠杆菌75

（三）用氯化钙法进行感受态大肠杆菌的制备与转化76

（四）假单孢细菌的转化78

二、酵母DNA转化79

（一）以球形体法为基础的裂殖酵母的转化方法80

（二）醋酸锂法为基础的转化酵母的方法82

三、哺乳动物细胞的DNA转染84

（一）用磷酸钙法进行哺乳动物细胞的转染84

（二）DEAE-Dextran转染法87

（三）阳离子脂质体介导的转染89

（四）脂质体介导的转染法91

辅助方案：转染的甘油处理92

辅助方案：用Hirt氏提取法抽提染色体外游离DNA93

四、逆转录病毒介导的基因转移95

一、在大肠杆菌中表达重组蛋白99

第六节 基因表达与调控99

二、利用杆状病毒在昆虫细胞中进行蛋白表达104

三、外源DNA在蟾蜍卵及胚中的表达113

四、VTF7-3株重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中瞬时表达122

五、反义技术123

（一）寡聚脱氧核苷酸——合成的DNA或RNA124

（二）反义RNA：从载体/cDNA克隆转录而来的反义RNA130

（三）反义RNA或DNA转导靶细胞的方法132

（四）反义DNA或RNA功能的检测133

（一）细菌质粒DNA的小量制备139

1.煮沸法139

一、质粒DNA的提取139

第七节 DNA的提取139

2.碱裂解法140

3.测序用质粒DNA的小量制备142

4.单链质粒DNA的小量制备144

5.质粒DNA的快速小量制备145

6.不需要苯酚抽提的质粒DNA小量制备147

7.丁香假单胞菌Pseudomonas syringae质粒DNA的小量制备148

8.用商品化试剂盒小量制备质粒DNA150

9.用瞬间小量制备试剂盒进行2min小量制备152

1.碱裂解法大量制备质粒DNA153

（二）细菌质粒DNA的大量制备153

2.用PEG沉淀法进行质粒DNA大量制备155

3.单链质粒DNA的大量制备157

4.用氯化铯离心法大量制备质粒DNA158

（三）酵母质粒DNA的分离161

1.酵母质粒DNA的小量制备162

2.酵母质粒DNA的大量制备163

3.YAC DNA的分离164

二、基因组或其他DNA的抽提166

（一）哺乳动物细胞基因组DNA的抽提166

（二）真核生物DNA的分离169

（三）从植物中分离基因组DNA173

（四）用CTAB抽提植物DNA176

（五）从琼脂糖凝胶上分离DNA片段179

（六）从琼脂糖凝胶上洗脱DNA片段181

第八节 DNA的酶修饰183

一、DNA聚合酶和聚合反应183

二、用外切核酸酶Ⅱ产生单向缺失185

三、用磷酸酶使DNA脱磷酸化188

四、用多核苷酸激酶使DNA磷酸化189

五、利用RNA酶处理制备不含RNA的DNA191

六、DNA连接192

七、用32P或生物素标记DNA探针194

第九节 DNA检测与图谱分析197

一、Southern杂交197

二、快速Southern杂交法197

三、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析208

四、用聚合酶链式反应分析微卫星DNA遗传多态性214

第十节 DNA序列分析217

一、用Klenow酶进行双/单链DNA序列分析217

二、用Taq?DNA聚合酶对RNA和cDNA进行序列分析221

第十一节 突变224

一、单向DNA缺失突变株的产生224

二、寡聚核苷酸介导的克隆DNA的定点突变234

辅助方案237

方法1：如何制备辅助噬菌体R408237

方法2：如何滴定噬菌体贮备液238

方法3：快速制备少量质粒DNA以用于测序239

第二章 核糖核酸（RNA）242

第一节 RNA和凝胶电泳242

一、RNA和无RNA酶的环境242

二、RNA凝胶电泳244

第二节 RNA的分离248

一、RNA一步分离法248

二、使用TRI REAGENT一步分离RNA250

三、从大肠杆菌中分离RNA251

四、用CsCl法从动物组织中分离RVA252

五、用寡聚（dT）纤维素分离多聚（A）+RNA254

六、从RNA表达载体中制备RNA转录物256

第三节 RNA的合成和加工261

一、RNA的化学合成261

二、RNA标记264

三、RNA测序268

四、用催化性RNA切割RNA专一位点272

五、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）274

六、竞争性RT-PCR276

七、一步RT-PCR281

八、信使RNA的差别显示283

九、核的失控转录测定291

十、RNA的体外剪接295

第四节 RNA的检测和作图297

一、Northern杂交297

二、Northern杂交：一种快速方法301

三、原位杂交303

四、RNase A/T1保护和RNase H聚焦法313

五、Fe(Ⅱ)-EDTA保护测定法319

六、用引物延伸法进行RNA作图320

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳325

第三章 蛋白质325

第一节 蛋白质电泳325

二、变性凝胶电泳（SDS-PAGE）327

三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）333

四、琼脂糖凝胶免疫电泳338

五、火箭电泳341

六、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳342

七、染色凝胶中的蛋白349

（一）考马斯亮蓝染色法349

（二）银染法351

（三）染色转印膜上的蛋白质352

八、凝胶的干燥354

第二节 蛋白质的提取与分离355

一、条件培养基的制备356

二、膜蛋白的提取357

三、用于蛋白质检测的细胞裂解物的制备358

第三节 蛋白质的检测和控制360

一、酶联免疫吸附实验法（ELISA）360

二、免疫沉淀法363

三、蛋白质印迹法366

四、增强化学发光蛋白免疫印迹法368

五、蛋白质配基印迹法370

六、配基和蛋白质间的亲合交联试验法372

七、蛋白质和配基结合的免疫迁移移动测定法374

八、以125I标记的底物电泳检测蛋白酶的活性376

九、检测蛋白酶的酶谱法379

十、流式细胞术中的细胞免疫染色381

十一、细胞蛋白的标记385

十二、微量蛋白质的自动氨基酸序列分析387

第四章 计算机辅助技术392

第一节 用于分子生物学的计算机程序392

一、GCG软件包（Genetics Computer Group Package）393

三、DNAStar-Lasergen394

二、Mac Vector计算机序列分析软件394

四、Primer Designer395

五、Entrez Sequences and References396

第二节 分子生物学中的计算机网络398

一、GenBank Retrieval（基因库）检索和序列相似性搜寻398

二、其他用于分子生物学的网络数据库或服务器401

第三节 计算机网络中的生物信息402

第四节 用GCG程序设计PCR引物407

附录417

供应商423

名词426

索引433