RNA分离与鉴定实验指南：RNA研究方法 原著第3版PDF|Epub|txt|kindle电子书版本下载

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第1章 RNA与细胞生物学1

1.1 为什么研究RNA1

1.2 RNA是什么2

1.3 多核苷酸的合成3

1.4 RNA的种类5

1.5 严谨度——影响核酸结构的条件5

1.5.1 盐对严谨度的影响6

1.5.2 pH对严谨度的影响6

1.5.3 温度对严谨度的影响7

1.5.4 甲酰胺对严谨度的影响7

1.6 双链分子的类型7

1.7 参考文献8

第2章 真核基因的转录与组织9

2.1 转录和中心法则9

2.1.1 调控元件10

2.1.2 DNA模板11

2.2 基因组织11

2.3 RNA聚合酶和转录产物13

2.4 参考文献15

第3章 信使RNA17

3.1 典型mRNA分子的拓扑结构17

3.1.1 5′帽子17

3.1.2 前导序列18

3.1.3 编码区19

3.1.4 尾部序列19

3.1.5 聚腺苷尾19

3.1.6 细胞器mRNA21

3.2 细胞质内的稳定性21

3.3 调控水平21

3.4 参考文献22

第4章 核糖核酸酶26

4.1 基本原理26

4.2 核糖核酸酶活性的消除26

4.3 核糖核酸酶抑制剂的种类27

4.3.1 特异性RNase抑制剂27

4.3.2 非特异性RNase抑制剂28

4.4 器皿和试剂的准备29

4.4.1 二乙基焦碳酸酯30

4.4.2 替代方法——用消毒水冲洗31

4.4.3 过氧化氢31

4.4.4 氢氧化钠和十二烷基硫酸钠31

4.5 控制核酸酶活性的其他试剂32

4.5.1 盐酸胍32

4.5.2 硫氰酸胍32

4.5.3 十二烷基硫酸钠32

4.5.4 N-十二烷基肌氨酸钠32

4.5.5 苯酚∶氯仿∶异戊醇32

4.5.6 8-羟基喹啉33

4.5.7 氯化铯33

4.5.8 三氟乙酸铯33

4.5.9 蛋白酶K34

4.5.10 RNAlater（RNA保护剂）34

4.6 实验方案：氧钒核糖核苷复合物的合成34

4.7 参考文献35

第5章 RNA分离策略37

5.1 基本原理37

5.2 RNA纯化的目的38

5.3 裂解缓冲液的组成40

5.3.1 温和的裂解缓冲液40

5.3.2 离液裂解缓冲液44

5.4 用含有胍离子的缓冲液分离RNA45

5.5 胍-酸-酚抽提技术46

5.5.1 实验方案：胍-酸-酚抽提46

5.6 密度梯度离心47

5.6.1 氯化铯47

5.6.2 三氟乙酸铯50

5.7 同时分离RNA和DNA53

5.7.1 实验方案：同时分离RNA和DNA53

5.8 试剂盒55

5.8.1 硅胶技术55

5.9 其他方法56

5.9.1 实验方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA56

5.9.2 实验方案：原核RNA的分离57

5.9.3 实验方案：酵母RNA的分离58

5.10 纯化RNA的短期保存和长期保存59

5.11 参考文献60

第6章 从组织中提取RNA62

6.1 基本原理62

6.2 组织培养或组织62

6.2.1 细胞培养的优点63

6.2.2 组织样品的优点63

6.3 匀浆方法63

6.3.1 Polytron破碎64

6.3.2 杜恩斯匀浆64

6.4 从不同器官和组织分离RNA的方法65

6.4.1 新鲜组织65

6.4.2 冷冻组织66

6.4.3 固定组织67

6.5 实验方案：用氯化锂-尿素法从组织分离RNA67

6.6 实验方案：从富含脂类的组织分离RNA69

6.7 纯化嵌合在多核糖体的mRNA70

6.7.1 实验方案：嵌入多核糖体的mRNA的提取71

6.8 实地采集生物样品72

6.9 RNA“净化”方法73

6.10 参考文献73

第7章 多聚腺苷酸RNA的分离76

7.1 基本原理76

7.2 多聚腺苷酸化77

7.3 poly（A）的解释说明77

7.4 多聚腺苷酸化mRNA的分离79

7.5 用磁珠技术纯化poly(A)+RNA80

7.5.1 实验方案：用磁珠纯化poly(A)+RNA81

7.6 oligo（dT）纤维素柱层析83

7.6.1 实验方案：生理量的poly(A)+RNA纯化84

7.7 快速非柱式纯化poly(A)+RNA87

7.7.1 实验方案：快速非柱式纯化poly(A)+RNA87

7.8 参考文献88

第8章 RNA制备的质量控制90

8.1 基本原理90

8.2 质量控制技术1：RNA的电泳检测90

8.2.1 实验方案92

8.3 质量控制技术2：紫外吸收光谱和吸收峰比值92

8.3.1 核酸浓度和纯度的鉴定93

8.4 质量控制技术3：RNA样品进行RT-PCR96

8.5 质量控制技术4：Northern分析96

8.6 质量控制技术5：RNA样品进行体外翻译97

8.7 参考文献97

第9章 斑点印迹分析98

9.1 基本原理98

9.2 斑点印迹的优点和缺点99

9.3 合适的阴性对照和阳性对照100

9.3.1 实验方案：RNA斑点印迹100

9.3.2 实验方案：DNA斑点印迹101

9.4 斑点印迹数据的局限性102

9.5 参考文献103

第10章 电泳104

10.1 基本原理104

10.2 核酸的标准化104

10.2.1 实验方案：poly（A）的标准化106

10.3 琼脂糖凝胶电泳中RNA样品变性方法108

10.3.1 甲醛变性法109

10.3.2 实验方案：甲醛变性胶110

10.3.3 乙二醛／二甲基亚砜变性法111

10.3.4 实验方案：乙二醛化与RNA电泳112

10.4 分子量标准113

10.4.1 分子量标准的正确使用114

10.4.2 核糖体RNA115

10.5 凝胶染色技术119

10.5.1 溴化乙锭119

10.5.2 SYBR绿121

10.5.3 SYBR金122

10.5.4 GelStar122

10.5.5 银染122

10.5.6 吖啶橙123

10.5.7 亚甲基蓝123

10.6 电泳过程中的安全问题124

10.7 电泳仪器的维护124

10.8 第一次进行琼脂糖凝胶电泳时的几点提示125

10.8.1 基本术语125

10.8.2 注意事项125

10.9 参考文献127

第11章 照片文档和图像分析130

11.1 基本原理130

11.2 照片文档130

11.2.1 样本可视化131

11.2.2 色彩过滤132

11.2.3 安全第一133

11.2.4 优化电泳图的一些小技巧133

11.2.5 照相技术和X射线胶片固有的局限性136

11.3 数字图像分析136

11.3.1 图像格式139

11.3.2 实践中需要考虑的问题139

11.4 参考文献141

第12章 Northern印迹分析142

12.1 基本原理142

12.2 滤膜的选取142

12.2.1 硝酸纤维素膜143

12.2.2 尼龙膜143

12.2.3 聚偏二氟乙烯膜144

12.3 膜的准备和取用144

12.4 Northern转膜技术145

12.4.1 毛细转膜法145

12.4.2 涡轮印迹器146

12.4.3 真空印迹法146

12.4.4 正压转膜法146

12.4.5 电转印迹法146

12.4.6 碱印迹法147

12.4.7 实验方案：用被动毛细扩散法转移RNA147

12.4.8 实验方案：用涡轮印迹器向下转移RNA149

12.5 转膜后膜的处理150

12.5.1 甲醛变性系统150

12.5.2 乙二醛变性系统151

12.6 固定技术151

12.6.1 烘烤151

12.6.2 紫外线照射交联151

12.6.3 实验方案：将RNA紫外交联于尼龙膜上152

12.7 固定后膜的处理152

12.8 参考文献153

第13章 核酸探针技术154

13.1 基本原理154

13.2 探针的分类155

13.3 标记系统的选择155

13.3.1 同位素标记156

13.3.2 非同位素标记159

13.4 DNA探针161

13.4.1 DNA探针的合成162

13.5 反义RNA探针164

13.5.1 RNA探针的特点166

13.5.2 RNA探针的合成166

13.6 探针的纯化167

13.7 探针的保存168

13.8 内源参照物168

13.9 参考文献170

第14章 核酸杂交应用172

14.1 基本原理172

14.2 影响杂交动力学和特异性的因素172

14.2.1 温度173

14.2.2 离子强度173

14.2.3 pH174

14.2.4 探针长度174

14.2.5 探针浓度174

14.2.6 （G+C）含量174

14.2.7 错配175

14.2.8 探针的复杂性175

14.2.9 黏性175

14.2.10 甲酰胺176

14.3 杂交温度176

14.3.1 长探针的Tm值计算176

14.3.2 寡核苷酸探针的Tm值计算176

14.4 杂交和Northern分析177

14.4.1 预杂交：滤膜处理177

14.4.2 实验方案：预杂交（长探针）178

14.4.3 探针变性178

14.4.4 杂交179

14.4.5 杂交后严格洗涤179

14.5 参考文献179

第15章 检测原理181

15.1 基本原理181

15.2 放射自显影182

15.2.1 滤膜的处理183

15.2.2 X射线胶片183

15.2.3 安全灯184

15.2.4 曝光时间185

15.2.5 增感屏185

15.2.6 荧光成像法186

15.2.7 胶片预闪186

15.2.8 暗盒的规格186

15.2.9 显影与定影187

15.2.10 放射自显影：推荐方案187

15.3 非同位素方法188

15.3.1 生物素189

15.3.2 地高辛190

15.3.3 荧光标记的核苷酸190

15.3.4 直接酶标法191

15.3.5 化学发光检测法191

15.3.6 显色检测法193

15.4 数字成像系统193

15.5 参考文献194

第16章 核酸酶保护法定量测定特定的mRNA196

16.1 基本原理196

16.2 基本方法198

16.3 探针选择200

16.4 优化建议202

16.5 可能的困难203

16.6 实验方案：S1核酸酶保护分析法定量转录产物204

16.7 实验方案：RNase保护分析法定量转录产物206

16.8 参考文献208

第17章 核RNA分析210

17.1 基本原理210

17.2 转录速率的检测210

17.3 实验方案：核逃逸实验（新生mRNA分析技术）213

17.3.1 细胞收集及细胞核的制备213

17.3.2 用NP-40缓冲液裂解细胞214

17.3.3 细胞核制备的备选方案：从组织培养的细胞中分离易损细胞核214

17.3.4 细胞核制备的备选方案：从完整组织中分离细胞核215

17.3.5 转录物的标记216

17.3.6 标记转录物的回收217

17.3.7 靶DNA的制备218

17.3.8 用于杂交的RNA的制备219

17.3.9 杂交后的洗脱和检测220

17.4 实验方案：核逃逸实验（备选方法）220

17.5 实验方案：核酸酶保护和脉冲标记转录法222

17.6 RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ活性的区分223

17.7 提取用于稳态分析的核RNA224

17.8 实验方案：直接分离核RNA225

17.9 实验方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA226

17.10 参考文献227

第18章 cDNA合成229

18.1 基本原理229

18.2 cDNA合成概述229

18.2.1 第一链合成的注意事项231

18.2.2 第二链合成的注意事项235

18.3 核定cDNA合成的效率237

18.4 连接的注意事项237

18.5 参考文献238

第19章 反转录聚合酶链反应239

19.1 基本原理239

19.2 聚合酶链反应概述239

19.3 反转录聚合酶链反应基本方法243

19.4 实验室设计246

19.5 引物设计246

19.5.1 基本标准250

19.5.2 Tm值251

19.6 优化程序252

19.7 PCR产物的分析256

19.8 RT-PCR质量监控点256

19.9 相关技术258

19.9.1 cDNA 5′末端快速扩增PCR258

19.9.2 cDNA 3′末端快速扩增PCR260

19.9.3 巢式PCR261

19.10 实验方案：cDNA第一链的合成261

19.11 实验方案：PCR反应扩增cDNA262

19.12 PCR产物的克隆263

19.13 实验方案：平末端PCR产物的末端加A264

19.14 实验方案：TA克隆的连接反应264

19.15 TOPO克隆266

19.16 参考文献266

第20章 定量PCR技术268

20.1 基本原理268

20.2 灵敏度指标268

20.3 定量方法269

20.4 内源参照物270

20.5 外源参照物272

20.6 对照反应的规划273

20.7 关于负对照276

20.8 竞争PCR的关键因素276

20.9 竞争PCR的主要步骤280

20.10 实验方案：竞争PCR281

20.10.1 非同源竞争模板的合成282

20.10.2 第一链cDNA的合成283

20.10.3 竞争PCR（初级扩增）283

20.10.4 竞争PCR（次级扩增）285

20.11 关于图像分析的考虑286

20.12 竞争PCR的问题解答287

20.13 实时PCR289

20.14 参考文献292

第21章 转录差减法296

21.1 基本原理296

21.2 关键问题297

21.3 差减-校正PCR298

21.4 非PCR差减302

21.5 差减法的问题与解决办法303

21.6 参考文献305

第22章 mRNA差异显示307

22.1 基本原理307

22.2 一般过程307

22.3 物的多样性：预期得到什么314

22.4 实验方案：mRNA差异显示316

22.4.1 cDNA的合成316

22.4.2 通过PCR扩增cDNA的各个组分316

22.4.3 PCR产物分析317

22.5 实验方案：差异表达序列的鉴定和筛选319

22.6 用亲和俘获回收差异表达的序列320

22.7 PCR产物的克隆320

22.8 差异表达的验证321

22.9 进一步的鉴定321

22.10 差异显示的应用322

22.11 mRNA差异显示的问题与解决方法322

22.12 参考文献324

第23章 基因表达的高通量分析326

23.1 基本原理326

23.2 微阵列是什么326

23.3 微阵列能做什么327

23.4 微阵列不能做什么329

23.5 微阵列分析的主要步骤329

23.6 参比RNA331

23.7 应用331

23.8 参考文献332

第24章 RNA干扰——目标基因的沉默333

24.1 基本原理333

24.2 重要的RNAi术语334

24.3 RNAi是如何工作的335

24.3.1 siRNA的导入途径336

24.3.2 shRNA的导入方法337

24.3.3 DNA指导的RNAi技术338

24.3.4 siRNA导入哺乳动物细胞的技术339

24.4 有效的siRNA设计339

24.5 体外和体内的问题340

24.6 参考文献342

第25章 基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学345

25.1 基本原理345

25.2 重要术语346

25.3 基因组与基因组学346

25.4 转录组与转录组学347

25.5 蛋白质组与蛋白质组学348

25.6 生物信息学349

25.7 参考文献351

第26章 一个RNA范例352

26.1 典型实验353

26.2 灵敏度的问题355

26.3 有待进行的355

26.4 到哪儿去寻求帮助357

尾声358

智慧的结晶358

附录362

附录1 保存完整和准确的记录362

附录2 储存液363

附录3 苯酚的制备367

附录4 溴化乙锭和SYBR绿溶液的处置369

附录5 用DNaseⅠ去除RNA样品中的DNA371

附录6 用RNase去除DNA样品中的RNA372

附录7 甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子化373

附录8 硅烷化离心管和玻璃器皿373

附录9 分子生物学家的主流工具——离心法373

附录10 胰蛋白酶消化贴壁细胞的方法377

附录11 用盐析法分离高分子量DNA378

附录12 从植物组织中分离RNA380

附录13 电泳——原理、参数和安全380

附录14 聚丙烯酰胺凝胶电泳388

附录15 仪器、试剂和服务的供应商389

附录16 SI词头393

附录17 通用缩写393

附录18 商标引用394

术语表397

索引409