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第1章 绪论1

1.1 基因工程的发展历程1

1.1.1 基因概念提出2

1.1.2 基因结构与功能2

1.1.3 基因操作关键技术突破4

1.1.4 基因工程问世4

1.2 基因工程大学科与大科学5

1.2.1 海量基因信息6

1.2.2 复杂基因网络7

1.2.3 基因工程系统7

1.3 基因工程研究的意义7

1.3.1 揭示生命现象规律7

1.3.2 基因工程与疾病治疗8

1.3.3 基因工程产业8

思考题10

第2章 基因工程基本技术原理11

2.1 核酸的提取与鉴定11

2.1.1 基因组DNA的提取11

2.1.2 RNA的提取14

2.1.3 质粒DNA的提取15

2.1.4 核酸的凝胶电泳18

2.1.5 变性梯度凝胶电泳20

2.1.6 核酸的定量与纯度的测定21

2.2 PCR技术21

2.2.1 PCR的原理22

2.2.2 PCR的操作22

2.2.3 PCR衍生技术24

2.2.4 PCR定点诱变27

2.3 核酸序列测定30

2.3.1 Sanger双脱氧链终止法31

2.3.2 Maxam-Gilbert化学修饰法32

2.3.3 Roche 454测序32

2.3.4 Illumina测序33

2.3.5 ABI SOLiD测序34

2.3.6 HeliScope测序36

2.3.7 单分子测序36

2.3.8 纳米孔测序技术37

2.4 分子杂交技术37

2.4.1 Southern杂交37

2.4.2 Northern杂交39

2.4.3 Western杂交40

2.4.4 菌落原位杂交41

2.4.5 荧光原位杂交42

思考题43

第3章 基因工程工具酶44

3.1 限制性核酸内切酶44

3.1.1 限制和修饰现象44

3.1.2 限制性核酸内切酶的类型45

3.1.3 Ⅱ型限制性核酸内切酶的命名48

3.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素48

3.2 DNA聚合酶50

3.2.1 大肠杆菌DNA聚合酶50

3.2.2 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段51

3.2.3 T4 DNA聚合酶51

3.2.4 T7 DNA聚合酶（修饰的T7 DNA聚合酶）52

3.2.5 实验室常用的耐热DNA聚合酶52

3.2.6 逆转录酶53

3.3 DNA连接酶53

3.3.1 DNA连接酶的类型53

3.3.2 DNA连接酶的特点54

3.3.3 连接反应的机制55

3.3.4 影响连接反应的因素55

3.4 核酸修饰酶57

3.4.1 末端脱氧核苷酸转移酶57

3.4.2 T4多核苷酸激酶57

3.4.3 碱性磷酸酶58

3.4.4 核酸外切酶59

3.4.5 单链DNA内切酶60

3.4.6 甲基化酶61

思考题63

第4章 基因工程载体与表达系统64

4.1 载体概述64

4.1.1 载体研究背景64

4.1.2 载体共性特征65

4.2 克隆载体类型65

4.2.1 质粒载体65

4.2.2 噬菌体载体70

4.2.3 噬菌粒载体73

4.2.4 病毒载体73

4.2.5 人工染色体克隆载体74

4.3 原核表达系统74

4.3.1 原核表达载体高效表达的元件74

4.3.2 大肠杆菌表达系统77

4.4 真核生物表达系统82

4.4.1 酿酒酵母表达系统82

4.4.2 巴斯德毕赤氏酵母表达系统82

4.4.3 酵母表达系统的应用83

思考题83

第5章 目的基因分离与鉴定84

5.1 基因文库法获取目的基因84

5.1.1 基因文库的构建84

5.1.2 cDNA文库的构建86

5.1.3 筛选基因文库获得目的基因87

5.2 PCR技术分离目的基因87

5.2.1 已知基因全长序列87

5.2.2 已知基因部分序列88

5.3 图位克隆获得目的基因89

5.4 转座子标签法获得目的基因90

5.5 电子克隆91

5.6 目的基因的鉴定91

5.6.1 表型检测法92

5.6.2 核酸探针杂交法93

5.6.3 PCR筛选和序列鉴定法94

5.6.4 物理特性检测法94

思考题95

第6章 基因功能研究技术96

6.1 常规分析技术96

6.1.1 基因沉默96

6.1.2 基因敲除104

6.2 高通量分析技术108

6.2.1 基因芯片108

6.2.2 蛋白芯片109

6.3 大分子相互作用分析技术109

6.3.1 免疫共沉淀110

6.3.2 染色质免疫沉淀技术110

6.3.3 RNA免疫沉淀法111

6.3.4 酵母双杂交111

6.3.5 光遗传114

思考题115

第7章 动植物基因工程116

7.1 转基因植物116

7.1.1 植物基因工程的常用方法116

7.1.2 转基因植物的筛选与鉴定122

7.1.3 提高外源基因在植物中表达水平的策略125

7.1.4 转基因植物的应用128

7.2 转基因动物131

7.2.1 动物基因工程的常用方法131

7.2.2 转基因动物的筛选与鉴定136

7.2.3 提高外源基因在动物中表达水平的策略137

7.2.4 转基因动物的应用139

思考题146

第8章 基因信息分析技术147

8.1 常用生物分子数据库147

8.1.1 核酸数据库147

8.1.2 蛋白质序列数据库151

8.1.3 其他常用生物分子数据库152

8.2 软件分析应用155

8.2.1 用BLAST进行局部序列比对155

8.2.2 用CLUSTAL进行多序列比对156

8.2.3 用Primer Premier进行引物设计156

8.2.4 限制性内切酶分析157

8.2.5 用JASPAR查找转录因子结合位点158

8.2.6 EMBOSS工具包158

8.2.7 其他常用生物信息学软件160

思考题160

主要参考文献162