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第一篇 微生物学基本实验技术2

第一章 微生物学实验室设备及实验器材2

第一节 细菌学实验室建设2

一、细菌学实验室设置基本条件2

二、基本设备和器具2

三、几种仪器的管理和使用2

第二节 病毒学实验室的建设3

一、病毒学实验室的设置要求3

二、几种仪器的保护与使用4

第三节 常用实验器材的准备5

一、清洁法5

二、消毒与灭菌法7

【附1-1】清洗液的配制9

参考文献10

第二章 细菌的形态学检查方法11

第一节 细菌大小的测定方法11

一、基本原理11

二、器材11

三、试验方法11

第二节 细菌形态的检查方法12

一、检查工具——普通光学显微镜的使用及保护12

二、暗视野显微镜检查法14

三、细菌不染色标本检查法15

四、细菌染色标本检查法15

第三节 细菌特殊结构的检查方法18

一、英膜染色法18

二、鞭毛染色法19

三、芽孢染色法20

参考文献21

第三章 细菌的培养技术22

第一节 培养基的种类和应用22

一、培养基的种类22

二、培养基的应用22

第二节 培养基的制备23

一、调配23

二、溶化23

三、校正pH值23

四、澄清过滤23

五、分装24

六、灭菌24

七、检定24

八、保存24

第三节 细菌培养分类及应用24

一、分批培养24

二、连续培养24

三、应用25

第四节 细菌的培养25

一、细菌的接种方法25

二、细菌的培养方法27

三、细菌L型的分离培养28

【附3-1】Diene染色法与857培养基的制备30

参考文献31

第四章 细菌的生化鉴定32

第一节 糖（醇）类代谢试验32

一、氧化-发酵试验（OF试验）32

二、甲基红试验（MR试验）32

三、V-P（Voges-Proskauer）试验33

四、β-半乳糖苷酶试验33

五、七叶苷水解试验34

六、淀粉水解试验34

七、甘油复红试验34

八、石蕊牛乳试验35

第二节 氨基酸和蛋白质代谢试验35

一、靛基质（吲哚）试验35

二、硫化氢试验35

三、尿素酶试验36

四、明胶液化试验36

五、苯丙氨酸脱氨酶试验36

六、氨基酸脱羧酶试验37

七、精氨酸双水解酶试验37

八、肉渣消化试验37

第三节 有机酸盐和胺盐利用试验38

一、枸橼酸盐利用试验38

二、丙二酸盐利用试验38

三、马尿酸钠水解试验——三氯化铁法38

四、马尿酸钠水解试验——茚三酮法39

五、乙酸盐利用试验39

六、惟一碳源试验39

七、惟一氮源试验40

八、生长因子试验40

第四节 呼吸酶类试验41

一、过氧化氢酶试验41

二、氧化酶试验41

三、硝酸盐还原试验41

四、氯化三苯四氮唑试验42

第五节 毒性酶类试验43

一、血浆凝固酶试验43

二、磷酸酶试验43

三、链激酶试验43

四、卵磷脂酶44

五、DNA酶试验44

第六节 其他试验44

一、胆盐溶菌试验44

二、CAMP试验45

三、杆菌肽抑菌试验45

四、Optochin敏感试验45

五、新生霉素抑菌试验46

六、呋喃唑酮抑菌试验46

七、0/129抑菌试验46

参考文献47

第五章 病毒的观察、培养鉴定及检测方法48

第一节 电子显微镜观察病毒法48

一、电子显微镜48

二、电镜负染观察病毒方法48

三、免疫电镜观察病毒形态49

第二节 病毒的分离培养与鉴定49

一、鸡胚培养技术50

二、组织培养技术52

三、动物接种56

第三节 血清学检查法58

一、中和试验58

二、血凝及血凝抑制试验61

三、补体结合试验62

四、凝胶免疫扩散试验62

参考文献63

第六章 真菌的常规检查法64

第一节 真菌的一般检验法64

一、不染色标本直接检验法64

二、染色标本检查法65

第二节 产毒真菌的检验65

【附6-1】常见霉菌特征67

第三节 真菌的培养方法68

一、斜面培养68

二、玻片培养68

三、平板培养法69

第四节 酵母菌的检查与鉴定69

一、酵母菌直接镜检计数法69

二、酵母菌的鉴定69

三、白假丝酵母菌的鉴定69

四、隐球菌的鉴定70

参考文献70

第七章 支原体的检测71

第一节 概述71

一、分离培养技术71

二、支原体分型试验71

三、支原体污染细胞培养的检测方法73

第二节 细胞培养中支原体污染的检测74

一、培养法检测支原体74

二、荧光染色法（DNA染色法）检测支原体74

三、PCR法检测支原体76

四、支原体的扫描电镜检测77

参考文献79

第八章 衣原体的检测80

一、衣原体特异性抗原和抗体检测80

二、特异性核酸检测81

参考文献81

第九章 微生物数量的测定82

第一节 显微镜直接计数法82

一、材料83

二、方法83

第二节 平板培养计数法84

一、材料84

二、方法84

第三节 最大可能数计数法85

一、材料86

二、方法86

第四节 光电比浊计数法86

一、材料86

二、方法87

第五节 滤膜法87

一、材料87

二、方法87

第六节 病毒计数88

一、材料88

二、方法88

三、影响蚀斑形成的因素88

参考文献89

第十章 微生物毒力的测定90

第一节 内毒素的测定——鲎试验90

一、材料90

二、方法90

三、结果90

第二节 外毒素的毒性检测90

一、材料91

二、方法91

三、结果91

第三节 病毒毒力测定91

一、材料92

二、方法92

三、注意事项93

第四节 细菌毒力的检测93

一、材料93

二、方法93

参考文献94

第十一章 菌株、毒株的保存方法95

第一节 菌株的保存与管理95

一、菌种的保存95

二、菌种保管95

三、常用的保存菌种的方法96

第二节 毒株的保存99

参考文献100

第十二章 药物敏感试验101

第一节 细菌的耐药机制101

一、细菌耐药性的概念101

二、细菌耐药性的产生机制101

第二节 需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感性试验105

一、体外药敏试验的抗菌药物选择105

二、抑菌试验108

三、联合药物敏感试验和杀菌试验119

四、检测细菌耐药性的其他方法121

第三节 厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验130

一、稀释法130

二、E试验132

第四节 酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验132

一、常量（试管）肉汤稀释法132

二、微量肉汤稀释法133

第五节 结核分枝杆菌的体外抗菌药物敏感试验133

一、临床实验室进行结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验的指征133

二、体外药敏试验抗分枝杆菌的药物选择133

三、抗分枝杆菌药物原液的配制及保存133

四、培养基133

五、结核分枝杆菌体外药敏试验方法133

六、结核分枝杆菌体外药敏试验的质控菌株135

参考文献135

第十三章 微生物实验室质量控制137

第一节 常规仪器的质量控制137

一、灭菌器的效果检测137

二、恒温孵育箱、水浴箱及冰箱138

三、厌氧箱及厌氧罐138

四、CO2培养箱138

五、生物安全罩138

六、细菌培养仪139

七、微生物鉴定仪139

八、其他仪器139

第二节 标准菌株的质量控制139

一、质控标准菌株应具备的条件139

二、质控标准菌株的来源139

三、标准菌株的保存139

第三节 培养基的质量控制140

一、建立制备培养基的记录140

二、培养基的外观检查141

三、无菌试验141

四、培养基的一般质量控制141

五、培养基的性能监测142

第四节 药敏试验的质量控制143

一、扩散法的质量控制143

二、稀释法的质量控制147

三、用标准菌株对厌氧菌药敏试验进行质量控制149

四、结核分枝杆菌药敏试验的质量控制150

第五节 其他项目的质量控制150

一、试剂、染色液及抗血清的质量控制150

二、处理临床标本的质量控制152

参考文献153

第二篇 与微生物相关的实验技术156

第十四章 细胞培养技术156

第一节 概述156

一、培养细胞的生长类型156

二、培养细胞的生长特点156

三、培养细胞的生长条件157

第二节 常用的细胞培养方法158

一、原代培养158

【附14-1】培养要点159

二、传代细胞培养160

三、二倍体细胞培养161

四、其他培养（包括大规模培养）方法161

第三节 培养细胞的生长、增殖及其观察163

一、培养细胞的生长和增殖163

二、培养细胞生长和增殖的观察164

第四节 培养细胞的保存和运输165

一、组织块保存法165

二、细胞悬液保存法165

三、单层细胞保存法165

四、低温冻结保存和复苏166

五、细胞运输166

第五节 培养细胞污染的检测排除166

一、生物污染的检测166

二、微生物污染的防治167

第六节 培养细胞基本设备与器具168

一、基本设备168

二、常用器械169

三、培养器皿169

第七节 细胞培养液170

一、生理平衡盐溶液170

二、天然培养基170

三、合成培养液171

四、生长液和维持液171

五、无血清培养液172

第八节 细胞培养在病毒研究中的应用172

一、细胞培养的应用172

二、判断病毒生长复制的方法172

三、细胞培养在病毒研究工作中的价值173

参考文献173

第十五章 抗体的制备174

第一节 普通诊断血清的制备174

一、免疫原的制备174

二、免疫动物的选择175

三、免疫方法175

四、免疫血清的收获176

五、免疫血清的保存176

第二节 单克隆抗体技术176

一、概述176

二、B细胞杂交瘤的制备177

参考文献179

第十六章 免疫血清学检查方法180

第一节 凝集试验180

一、直接凝集反应180

二、间接凝集反应181

第二节 沉淀反应183

一、液体内沉淀反应183

二、凝胶内沉淀反应185

第三节 补体结合试验187

第四节 免疫荧光技术189

一、荧光标记物的制备189

二、荧光免疫显微技术191

三、流式荧光免疫技术192

四、时间分辨荧光免疫测定192

五、荧光偏振免疫测定193

第五节 酶免疫技术194

一、酶的选择与试剂的制备194

二、酶联免疫吸附测定198

三、细胞酶联免疫吸附测定199

四、液相酶免疫测定203

五、均相酶免疫测定204

第六节 放射免疫测定技术206

一、放射免疫测定206

二、免疫放射测定211

三、放射受体分析212

第七节 免疫金标记技术213

一、基本原理214

二、胶体金的制备214

三、胶体金标记蛋白的制备215

四、胶体金标记技术在免疫学试验中的应用217

第八节 化学发光标记及发光免疫测定219

一、发光现象219

二、化学发光220

三、生物发光221

四、发光标记物222

五、发光免疫标记技术223

六、发光免疫分析技术226

七、电化学发光免疫分析228

第九节 免疫电镜技术230

一、免疫标记方法230

二、铁蛋白标记免疫电镜技术231

三、酶标记免疫电镜技术232

四、胶体金标记免疫电镜技术232

五、凝集素标记免疫电镜技术232

六、免疫电镜技术的不标记抗体法233

参考文献234

第十七章 分子生物学技术236

第一节 细菌质粒指纹图谱分析236

一、琼脂糖凝胶电泳236

二、质粒的限制性内切酶分析239

第二节 细菌DNA（G+C）含量测定240

一、细菌DNA的提取240

二、细菌DNA（G+C）含量测定240

三、（G+C）含量在细菌分类鉴定中的应用242

第三节 核酸杂交技术245

一、膜上印迹杂交245

二、核酸原位杂交248

第四节 PCR技术249

一、PCR技术的原理249

二、PCR技术在病原体诊断方面的应用249

三、PCR检测病原微生物应用实例250

第五节 生物芯片技术252

一、概述252

二、生物芯片在医学中的应用253

参考文献255

第十八章 其他微生物学检测技术256

第一节 细菌编码鉴定技术256

第二节 细菌自动化鉴定系统258

一、微生物数码分析鉴定系统258

二、自动化设备259

三、血培养检测和分析系统260

第三节 气相色谱技术在细菌学研究中的应用261

一、气相色谱仪262

二、气相色谱法的特点265

三、细菌分析应用举例265

参考文献267

第十九章 电泳技术268

第一节 概论268

一、电泳法分类268

二、电泳的基本原理268

三、影响被分离物质迁移率的因素269

第二节 琼脂糖凝胶电泳271

一、琼脂糖凝胶的性质271

二、电泳装置271

三、电泳缓冲液271

四、凝胶浓度的选择271

五、常规琼脂糖凝胶电泳271

六、碱性琼脂糖凝胶电泳272

七、琼脂糖电泳分离血清脂蛋白273

第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳275

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳275

二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳277

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质278

第四节 等电聚焦电泳280

一、试剂及器材281

二、操作步骤281

三、注意事项282

四、评价282

参考文献282

第二十章 实验动物和动物实验技术283

第一节 实验动物学283

一、实验动物学的基本概念283

二、实验动物学的研究对象283

三、实验动物学的研究范围283

四、实验用动物285

第二节 实验动物285

一、实验动物分类286

二、实验动物对环境因素的要求298

第三节 动物实验技术305

一、实验动物的固定、编号和分组305

二、实验动物的麻醉308

三、实验动物的去毛、给药、采血和处死309

参考文献315

第二十一章 微生物遗传变异及相关技术316

第一节 遗传变异的物质基础316

一、细菌染色体316

二、质粒316

三、转位因子317

第二节 细菌转化实验318

一、材料318

二、方法318

三、结果319

第三节 细菌总DNA的提取319

一、材料319

二、方法319

第四节 细菌质粒DNA的提取321

一、材料321

二、方法321

第五节 细菌诱发突变的实验322

一、经紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株322

二、经亚硝酸诱变筛选乳糖发酵突变株324

三、转座子引起的插入突变325

参考文献326

第二十二章 各种临床标本的微生物学检查327

第一节 血液标本327

一、实验材料327

二、实验方法327

三、实验结果328

四、临床意义329

第二节 粪便标本329

一、实验材料329

二、实验方法329

三、实验结果330

四、临床意义331

第三节 尿液标本331

一、实验材料331

二、实验方法331

三、实验结果334

四、临床意义334

第四节 泌尿生殖道标本334

一、实验材料334

二、实验方法335

三、实验结果337

四、临床意义337

第五节 痰液及呼吸道标本337

一、实验材料337

二、实验方法337

三、实验结果339

四、临床意义339

第六节 脓液及创伤感染标本339

一、实验材料339

二、实验方法340

三、实验结果341

四、临床意义341

第七节 无菌体液（脑脊液、穿刺液）标本341

一、实验材料341

二、实验方法342

三、实验结果343

四、临床意义344

第八节 组织标本344

一、实验材料344

二、实验方法344

三、实验结果345

四、临床意义345

参考文献346

第三篇 各种环境中微生物的检测348

第二十三章 生活环境中致病菌的检测348

第一节 水环境中致病菌的检测348

一、水样的采集与处理348

二、水中沙门菌的分离348

三、水中志贺菌的分离348

四、水中霍乱弧菌的分离349

五、水中铜绿假单胞菌的分离349

第二节 空气环境中致病菌的检测349

一、固体撞击法检测空气中溶血性链球菌350

二、自然沉降法检测空气中溶血链球菌350

第三节 食品中常见致病菌的检测351

一、食品中沙门菌的检测351

二、食品中志贺菌属的检测352

参考文献353

第二十四章 医院感染中的微生物监测354

第一节 医院感染的特点354

一、医院感染的流行特点354

二、医院感染的微生物学特点355

第二节 医院感染的微生物学监测356

一、空气中细菌学监测356

二、物体表面的微生物学监测357

三、手微生物学污染监测358

四、敷料、纱布微生物学监测359

五、生物制品微生物学监测359

六、金属、玻璃器械微生物学监测359

七、消毒液的细菌学检测359

参考文献360

第二十五章 新发现微生物的检测361

第一节 SARS病毒的实验室检测361

一、病原生物学特性361

二、流行病学364

三、发病机制366

四、实验室诊断366

五、小结——SARS诊断依据369

附件25-1 非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南371

附件25-2 传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法372

第二节 禽流感病毒的实验室检测373

一、病原生物学特性374

二、流行病学374

三、临床表现375

四、诊断方法375

五、实验室诊断375

六、禽流感与人的关系376

附件25-3 中华人民共和国国家标准 流行性感冒诊断标准及处理原则377

附录A 病原学诊断方法378

附录B 血清学诊断方法380

附录C 红细胞凝集抑制试验380

附录D 神经氨酸酶活性抑制试验384

附录E 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验387

附录F 流感快速诊断方法390

附件25-4 禽流感病毒的实验室检测技术方案397

附件25-5 WHO甲5型（H5）流感病毒鉴定试剂盒的使用方法400

参考文献402

第四篇 生物战剂404

第二十六章 生物战剂404

第一节 病原微生物危险度等级404

一、一级危险度微生物404

二、二级危险度微生物404

三、三级危险度微生物404

四、四级危险度微生物406

第二节 生物战剂概况406

一、生物战剂的标准407

二、攻击人的生物战剂实验室危险度407

第三节 常用的病毒性生物战剂408

一、克里米亚-刚果出血热病毒409

二、汉坦病毒410

三、天花病毒412

四、马尔堡病毒415

五、埃博拉病毒416

六、森林脑炎病毒418

七、黄热病毒421

第四节 常用的细菌性生物战剂422

一、炭疽芽孢杆菌422

二、鼠疫耶尔森菌425

三、布鲁菌428

四、鹦鹉热衣原体432

第五节 常用的毒素性生物战剂434

一、葡萄球菌肠毒素434

二、肉毒毒素435

三、志贺毒素436

四、破伤风毒素437

第六节 常用的立克次体生物战剂439

一、普氏立克次体439

二、立氏立克次体441

第七节 常用的真菌生物战剂442

一、荚膜组织胞浆菌442

二、球孢子菌444

参考文献446

附录一 培养细菌的常用培养基447

附录二 几种常用的支原体培养基453

附录三 分子生物学试验常用培养基及试剂455

附录四 常用染色液456

附录五 组织培养常用试剂458

附录六 最大可能数表（MPN表）460

附录七 免疫学实验常用试剂及配制方法461

英汉对照表466