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第一篇 概述1

第一章 概况3

1.1 转基因农作物发展概况3

1.2 我国进口转基因农产品概况3

1.3 我国进出境转基因产品检测体系建设4

1.3.1 我国进出境转基因产品检测技术体系建设4

1.3.2 我国进出境转基因产品检测标准体系建设6

1.3.3 我国进出境转基因产品检测实验室体系建设7

1.4 农产品转基因成分检测靶标分析7

1.5 农产品转基因成分检测技术路线11

第二章 农产品转基因成分检测技术12

2.1 概况12

2.2 基于核酸的检测技术12

2.2.1 PCR12

2.2.2 实时荧光PCR13

2.2.3 PCR-DHPLC检测13

2.2.4 基因芯片检测14

2.2.5 生物传感器技术14

2.3 基于外源蛋白的检测技术15

第二篇 农产品转基因成分PCR-DHPLC检测17

第三章 农产品转基因成分PCR-DHPLC引物设计19

3.1 引物设计原理19

3.2 设计的引物序列19

第四章 农产品转基因成分单重PCR-DHPLC检测23

4.1 材料、试剂与仪器23

4.1.1 供试材料23

4.1.2 实验试剂24

4.1.3 引物序列24

4.1.4 主要仪器设备26

4.2 方法26

4.2.1 DNA提取26

4.2.2 PCR扩增26

4.2.3 DHPLC检测26

4.3 结果与分析27

4.3.1 内源基因检测27

4.3.2 筛查检测28

4.3.3 外源功能基因检测30

4.3.4 转基因品系检测33

4.4 结论49

第五章 农产品转基因成分多重PCR-DHPLC检测50

5.1 材料、试剂与仪器50

5.1.1 供试材料50

5.1.2 实验试剂50

5.1.3 引物序列50

5.1.4 主要仪器设备50

5.2 方法50

5.2.1 DNA提取50

5.2.2 PCR扩增50

5.2.3 DHPLC检测51

5.2.4 多重PCR-DHPLC特异性测定51

5.2.5 多重PCR-DHPLC灵敏度测定51

5.3 结果与分析51

5.3.1 转基因大豆检测51

5.3.2 转基因棉花检测52

5.3.3 转基因玉米检测55

5.3.4 转基因小麦检测56

5.3.5 转基因油菜检测57

5.4 结论59

第六章 农产品转基因成分PCR-DHPLC试剂盒研制60

6.1 转基因大豆DHPLC检测试剂盒研制60

6.1.1 引物60

6.1.2 反应体系60

6.1.3 反应条件61

6.1.4 试剂盒使用说明61

6.2 转基因棉花DHPLC检测试剂盒研制62

6.2.1 引物62

6.2.2 反应体系62

6.2.3 反应条件63

6.2.4 试剂盒使用说明63

6.3 转基因玉米DHPLC检测试剂盒研制64

6.3.1 引物65

6.3.2 反应体系65

6.3.3 反应条件65

6.3.4 试剂盒使用说明65

6.4 转基因水稻DHPLC检测试剂盒研制67

6.4.1 引物67

6.4.2 反应体系67

6.4.3 反应条件67

6.4.4 试剂盒使用说明67

6.5 转基因小麦DHPLC检测试剂盒研制68

6.5.1 引物68

6.5.2 反应体系的建立69

6.5.3 反应条件69

6.5.4 试剂盒使用说明69

第三篇 农产品转基因成分可视芯片检测技术71

第七章 农产品转基因成分可视芯片检测引物与探针设计73

7.1 引物与探针设计原则73

7.2 引物与探针设计方法73

7.2.1 引物设计73

7.2.2 探针设计76

7.3 引物与探针设计结果76

第八章 农产品转基因样品核酸制备79

8.1 材料、试剂与仪器79

8.1.1 供试材料79

8.1.2 实验试剂79

8.1.3 主要仪器设备79

8.2 方法79

8.2.1 样品保存79

8.2.2 CTAB法提取微量转基因样品DNA79

8.2.3 DNA浓度及纯度检测80

8.2.4 内源基因扩增验证80

8.3 结果与分析80

8.3.1 基因组DNA提取80

8.3.2 内源基因扩增验证80

8.4 讨论81

8.4.1 基因组DNA提取81

8.4.2 内源基因扩增验证82

第九章 引物、探针验证及光学薄膜生物传感器技术优化83

9.1 材料、试剂与仪器83

9.1.1 供试材料83

9.1.2 实验试剂83

9.1.3 主要仪器设备及耗材83

9.2 方法83

9.2.1 引物与探针保存83

9.2.2 PCR扩增84

9.2.3 点制探针芯片84

9.2.4 基本步骤84

9.2.5 技术优化84

9.2.6 引物及探针有效性及特异性验证84

9.3 结果85

9.3.1 光学薄膜生物传感器芯片技术优化85

9.3.2 引物与探针有效性及特异性验证85

9.4 讨论86

第十章 农产品转基因成分可视芯片—膜芯片检测技术88

10.1 材料、试剂与仪器88

10.1.1 材料88

10.1.2 主要仪器设备88

10.2 方法88

10.2.1 转基因玉米品系或结构特异性检测88

10.2.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测88

10.2.3 转基因棉花及油菜八重PCR—可视芯片检测90

10.3 结果与分析90

10.3.1 转基因玉米PCR-光学薄膜生物传感器芯片检测90

10.3.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测92

10.3.3 转基因棉花及油菜八重PCR—光学薄膜生物传感器芯片检测94

10.4 结论95

第十一章 农产品转基因成分可视芯片-微孔板芯片检测技术96

11.1 材料、试剂与仪器96

11.1.1 供试材料96

11.1.2 试剂97

11.1.3 引物探针97

11.1.4 主要仪器设备99

11.2 方法99

11.2.1 DNA提取99

11.2.2 DNA浓度的测定99

11.2.3 PCR扩增99

11.2.4 芯片探针制备100

11.2.5 杂交反应100

11.3 结果与分析100

11.3.1 特异性100

11.3.2 灵敏度101

11.4 结论102

第十二章 转基因作物可视芯片检测试剂盒研制104

12.1 DNA提取及纯度、浓度测定104

12.2 引物探针设计104

12.3 反应体系及条件104

12.4 试剂盒说明104

12.4.1 试剂盒组成104

12.4.2 引物信息105

12.4.3 检测芯片信息105

12.5 使用方法106

12.5.1 实验准备106

12.5.2 实验步骤106

12.5.3 结果判定106

第四篇 农产品转基因成分固相芯片检测及定性定量PCR检测109

第十三章 转基因大豆多重滚环扩增-基因芯片检测111

13.1 材料111

13.1.1 供试材料111

13.1.2 主要试剂及仪器设备111

13.2 方法111

13.2.1 锁式探针设计111

13.2.2 固相芯片点样111

13.2.3 固相芯片点样及预处理112

13.3 结果112

第十四章 检疫性真菌、病毒和转基因成分多重滚环扩增-基因芯片检测114

14.1 材料114

14.1.1 供试真菌菌株114

14.1.2 供试病毒毒株117

14.2 方法118

14.2.1 固相芯片点样118

14.2.2 多重特异性测试118

14.3 实验结果119

第十五章 转基因水果常规PCR检测方法120

15.1 材料、试剂与仪器120

15.1.1 供试材料120

15.1.2 实验试剂120

15.1.3 主要仪器设备121

15.2 方法121

15.2.1 植物基因组DNA的提取121

15.2.2 PCR检测121

15.2.3 PCR产物片段克隆122

15.3 结果与分析123

15.3.1 DNA提取123

15.3.2 插入外源基因表达结构123

15.3.3 基因特异性PCR124

15.3.4 基因特异性多重PCR129

15.4 结论130

第十六章 转基因水果实时荧光PCR检测方法131

16.1 材料、试剂与仪器131

16.1.1 供试材料131

16.1.2 实验试剂131

16.1.3 主要仪器设备131

16.2 方法131

16.2.1 引物探针131

16.2.2 扩增132

16.3 结果与分析133

16.3.1 检测灵敏度133

16.3.2 实时荧光PCR134

16.3.3 双重荧光PCR检测转基因木瓜140

16.4 结论140

第十七章 转基因油菜品系检测141

17.1 材料、试剂与仪器141

17.1.1 供试材料141

17.1.2 实验试剂142

17.1.3 主要仪器设备142

17.2 方法142

17.2.1 参试样DNA提取、纯化和测定142

17.2.2 DNA纯化143

17.2.3 DNA浓度和纯度测定143

17.2.4 引物设计143

17.2.5 单重PCR检测体系和条件的建立144

17.2.6 PCR产物鉴定144

17.2.7 多重PCR检测体系和条件筛选144

17.2.8 特异性检测145

17.2.9 多重PCR灵敏度检测145

17.2.10 重复性实验145

17.3 结果与分析145

17.3.1 单重PCR退火温度优化145

17.3.2 PCR产物测序145

17.3.3 多重PCR优化147

17.3.4 单重PCR特异性147

17.3.5 多重PCR特异性150

17.3.6 多重PCR灵敏度151

17.3.7 多重PCR的重复性检测151

17.4 讨论152

17.4.1 多重PCR检测的实用性152

17.4.2 多重PCR结合其他检测技术在转基因检测中的运用152

第十八章 转基因饲料检测方法研究153

18.1 材料、试剂与仪器153

18.1.1 供试材料153

18.1.2 试剂154

18.1.3 主要仪器设备154

18.2 方法154

18.2.1 DNA的抽提及浓度测定154

18.2.2 定量PCR检测155

18.2.3 PCR产物的凝胶电泳检测157

18.2.4 Southern blot检测157

18.2.5 DNA测序法158

18.3 结果与分析158

18.3.1 核酸制备158

18.3.2 定量PCR159

18.3.3 定性PCR扩增165

18.3.4 Southern blot168

18.3.5 测序168

18.4 讨论与结论169

18.4.1 讨论169

18.4.2 结论169

第十九章 转基因玉米和油菜品系数字PCR定量方法研究171

19.1 前言171

19.2 材料与方法171

19.2.1 材料171

19.2.2 实验方法171

19.3 结果与分析173

19.3.1 转基因玉米和油菜品系扩增稳定性结果173

19.3.2 转基因玉米和油菜品系特异性扩增结果182

19.3.3 转基因玉米和油菜品系的线性范围测定结果189

19.3.4 转基因玉米和油菜品系的定量检测限和检测限结果196

19.3.5 转基因玉米和油菜品系的精密度试验测定结果200

19.4 结论202

第五篇 农产品转基因成分溯源技术研究205

第二十章 出口产品转基因成分溯源平台开发207

20.1 RFID技术207

20.2 基于RFID的出口产品转基因成分溯源系统构成207

20.2.1 硬件构成207

20.2.2 软件构成208

20.3 结论210

第二十一章 出口大米及米制品非转基因溯源技术测试211

21.1 前言211

21.2 硬件211

21.3 测试方法212

21.4 测试结果214

21.5 结论215

第二十二章 出口产品转基因成分溯源技术体系全程溯源示范216

22.1 示范企业基地建设216

22.1.1 江西某食品有限公司场地调查216

22.1.2 某米业有限公司场地调查216

22.1.3 硬件设备安装测试216

22.1.4 软件安装调试218

22.1.5 硬件软件培训219

22.1.6 转基因管理制度建设219

22.2 企业现场示范研究220

22.2.1 江西某米粉厂现场示范研究220

22.2.2 某米业有限公司现场示范研究221

第六篇 农产品转基因成分检测计量与标准223

第二十三章 转基因检测质粒阳性参考物质研制225

23.1 材料、试剂与仪器225

23.1.1 供试材料225

23.1.2 实验试剂226

23.1.3 引物序列226

23.1.4 主要仪器设备226

23.2 实验方法226

23.2.1 DNA提取226

23.2.2 PCR扩增227

23.2.3 电泳227

23.2.4 PCR产物纯化227

23.2.5 连接T载体227

23.2.6 转化感受态细胞227

23.2.7 菌落PCR鉴定227

23.2.8 提取质粒228

23.2.9 克隆测序228

23.2.10 序列分析228

23.3 结果与分析228

23.3.1 大豆相关克隆228

23.3.2 棉花相关克隆228

23.3.3 玉米相关克隆229

23.3.4 水稻相关克隆232

23.3.5 小麦相关克隆233

23.4 结论240

第二十四章 植物转基因产品检测计量标准资源整合与共享调查241

24.1 调查方法241

24.1.1 调查对象241

24.1.2 调查时间241

24.1.3 调查方式241

24.1.4 调查内容241

24.1.5 调查步骤241

24.1.6 质量控制242

24.1.7 数据处理和分析方法242

24.2 结果242

24.2.1 转基因产品检测计量标准资源242

24.2.2 信息库的建设243

24.2.3 实物库建设243

24.3 讨论243

第二十五章 转基因成分测量计量标准资源分类技术规范244

25.1 前言244

25.2 范围244

25.3 引用文献244

25.4 定义244

25.5 转基因成分测量计量标准资源应符合的条件246

25.6 转基因成分测量计量标准资源的分类246

25.6.1 转基因成分测量参考标准资源246

25.6.2 转基因成分测量参考方法资源247

25.6.3 转基因成分检定规程资源247

25.6.4 转基因成分检测技术规范资源247

25.6.5 转基因产品管理和检测的政策法规247

25.6.6 转基因成分检测的比对信息资源247

25.6.7 转基因产品检测参考实验室资源248

25.6.8 转基因成分检测人才信息资源248

第二十六章 国内外转基因产品检测标准发展概况249

26.1 转基因产品检测国际标准249

26.2 转基因产品检测国外标准250

26.3 转基因产品检测国家标准252

26.4 转基因产品检测行业标准253

26.4.1 国家质检总局进出境转基因产品检测行业标准253

26.4.2 我国农业部门颁布的转基因产品检测行业标准255

26.4.3 我国林业部门转基因产品检测行业标准262

26.4.4 我国环保部门转基因产品检测行业标准262

26.4.5 我国烟草部门转基因产品检测行业标准263

26.5 结论与讨论263

附录 研究所形成的标准277

附录1 转基因产品检测 基因芯片检测方法279

附录2 转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法295

附录3 植物性饲料中转基因成分PCR检测方法300

附录4 转基因大豆DHPLC检测方法308

附录5 转基因棉花DHPLC检测方法312

附录6 转基因大米PCR-DHPLC检测方法316

附录7 转基因玉米检测微滴式数字PCR定量方法321

附录8 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米98140品系326

附录9 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米DAS40278-9品系331

附录10 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米VCO-01981-5品系336

附录11 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米MON87427品系341

附录12 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜73496品系346

附录13 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜RF2品系351

附录14 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜Topas19/2品系356

附录15 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜T45品系361

附录16 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜MON88302品系366

附录17 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜OXY235品系371

参考文献376