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第一章 基因工程的分子生物学基础1

第一节 遗传信息流的中心法则（central dogma）：DNN→RNA→蛋白质2

一、DNA合成3

二、RNA合成3

三、蛋白质合成3

第二节 核酸的生物化学4

一、核酸大分子的结构4

二、DNA双螺旋的变性与复性4

第三节 基因工程中采用的主要酶类7

一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶7

二、连接酶和激酶9

三、DNA聚合酶和RNA聚合酶9

第四节 研究DNA和RNA的方法10

一、核酸的分离纯化10

二、凝胶电泳10

三、DNA测序11

第五节 膜印迹和核酸杂交16

第六节 实例1：鉴别特定基因转录物的转录起始点18

一、研究目的18

二、可利用的信息和资源18

三、基本策略19

四、注释21

五、可供参考的思路21

习题21

第二章 原核生物分子克隆的宿主和载体系统24

第一节 应用广泛的细菌宿主24

一、E.coli K-12的生物学24

二、乳糖操纵子25

三、细菌限制与修饰系统27

四、大肠杆菌的克隆载体29

第二节 质粒载体29

一、质粒生物学29

二、质粒上常编码抗生素-抗性基因30

三、质粒DNA克隆载体32

四、通过转化将DNA转移到大肠杆菌中33

第三节 噬菌体克隆载体35

一、λ噬菌体的生物学35

二、λ噬菌体克隆载体36

三、M13噬菌体克隆载体39

第四节 外源DNA和载体的连接41

一、外源DNA和载体连接的方法41

二、定向克隆42

第五节 实例2：一个基因在E.coli中的调节表达44

一、研究目的44

二、可利用的信息和资源44

三、基本策略44

四、注释47

五、可供参考的思路47

习题47

第三章 基因文库的构建49

第一节 DNA基因文库50

一、基因组文库50

二、DNA文库的构建50

三、用于构建DNA文库的克隆载体53

第二节 亚克隆54

第三节 克隆DNA序列的体外诱变56

一、缺失诱变57

二、寡核苷酸定向诱变58

三、随机诱变60

四、PCR诱变法60

五、大引物诱变法61

第四节 实例3：基因编码序列的丙氨酸扫描诱变62

一、研究目的62

二、可利用的信息和资源62

三、基本策略62

四、注释63

五、可供参考的思路63

习题65

第四章 基因组DNA的分析67

第一节 基因组的组成68

一、大肠杆菌K-12基因组的组成68

二、酿酒酵母基因组的组成69

三、人类基因组的组成69

第二节 基因组作图71

一、用减数分裂的重组频率进行连锁作图72

二、用放射诱导染色体重排进行基因组作图72

三、用DNA序列多态性作为遗传标记进行基因组作图74

四、用遗传资料、DNA标记和克隆片段来构建连接群图谱76

第三节 长的基因组DNA片段的操作77

一、用荧光激活细胞分拣法来分拣染色体78

二、标签克隆法78

三、染色体的显微切割79

四、脉冲电场凝胶电泳79

第四节 基因组DNA克隆载体81

一、黏粒载体82

二、酵母人工染色体（YAC）载体83

三、细菌人工染色体（BAC）载体84

四、P1噬菌体载体和P1人工染色体85

五、哺乳动物人工染色体（MAC）载体85

六、用DNA池来筛选基因组文库86

第五节 基因调节序列的作图88

一、用体外表达进行基因调节序列作图88

二、定位蛋白质结合位点的分析方法89

三、电泳迁移率变动分析91

第六节 实例4：通过定点克隆分离一个人类致病基因92

一、研究目的92

二、相关信息和资源92

三、基本策略92

四、注释92

五、可供参考的思路93

习题94

第五章 cDNA文库的构建和筛选102

第一节 将RNA转变成cDNA102

一、mRNA的分离纯化102

二、cDNA合成104

三、cDNA克隆载体106

第二节 cDNA文库的筛选108

一、简并寡核苷酸探针109

二、抗体探针110

三、差示杂交112

四、扣除杂交113

第三节 cDNA表达文库的功能筛选114

一、蛋白质活性分析115

二、酵母双杂交系统115

三、cDNA噬菌体展示117

第四节 用克隆cDNA作为反应物119

一、RNA印迹119

二、RNase保护实验119

三、核连缀转录分析120

第五节 实例5：体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因122

一、研究目的122

二、可利用的信息和资源122

三、基本策略122

四、注释122

五、可供参考的思路124

习题124

第六章 聚合酶链反应126

第一节 基本的PCR方法126

一、PCR扩增循环127

二、PCR需要一种热稳定DNA聚合酶129

三、PCR引物的设计129

四、两个引物之间的最佳距离131

五、PCR实验的最优化131

第二节 反转录PCR132

一、cDNA末端快速扩增（RACE）132

二、定量RT-PCR134

三、差异表达基因的扩增136

四、肠道细菌基因间重复保守序列-聚合酶链反应139

第三节 PCR用于诊断139

一、在组织样本中检测病原体139

二、鉴别遗传突变140

三、用标签序列位点进行基因型分型141

第四节 PCR在实验室中的应用142

一、用PCR亚克隆靶DNA142

二、PCR介导产生融合基因144

第五节 解链酶复制法145

第六节 实例6：用RT-PCR克隆细胞特异转录物145

一、研究目的145

二、可利用的信息和资源145

三、基本策略146

四、注释148

五、可供参考的思路148

习题148

第七章 培养细胞中克隆基因的表达149

第一节 基因调控的研究149

一、表达载体149

二、报道基因151

三、反义技术156

四、RNA干扰158

第二节 基因在细胞系中表达的方法160

一、基因转染的策略161

二、瞬时转染164

三、稳定转染165

第三节 用酵母作为模式真核细胞167

第四节 蛋白质在培养细胞中的表达168

一、E.coli表达系统169

二、杆状病毒（baculovirus）表达系统170

第五节 实例7：启动子选择转录因子的研究171

一、研究目的171

二、可利用的信息和资源172

三、基本策略172

四、注释173

五、可供参考的思路175

习题175

第八章 转基因动植物176

第一节 果蝇发育的分子生物学176

一、P因子介导的转化177

二、P因子增强子捕获载体177

三、可介导转化的其他真核转座因子180

第二节 构建转基因的农作物181

一、根癌农杆菌介导的基因转移181

二、用基因枪制备转基因水稻和玉米183

第三节 转基因小鼠186

一、用受精卵细胞制备转基因小鼠186

二、通过干细胞的同源重组进行基因敲除189

三、人类疾病的转基因小鼠模型193

第四节 转基因家畜194

一、用转基因动物制备药物194

二、动物的体细胞克隆195

第五节 实例8：敲除转基因鼠产生特异基因199

一、研究目的199

二、可利用的信息和资源199

三、基本策略199

四、注释200

五、可供参考的思路201

习题201

第九章 基因治疗205

第一节 基因治疗的策略206

一、体细胞基因治疗的策略206

二、基因治疗的关键步骤208

三、基因治疗的靶细胞的选择209

四、体细胞基因治疗的途径209

第二节 基因转移的方法210

一、基因转移的非生物方法211

二、基因转移的病毒方法212

第三节 基因治疗药物218

一、p53抑癌基因218

二、siRNA219

三、反义RNA221

四、核酶221

五、肽核酸224

六、三链DNA225

七、自杀基因227

第四节 基因治疗的安全性228

第五节 实例9：重症联合免疫缺陷的基因治疗229

一、研究目的229

二、可利用的信息和资源229

三、基本策略230

习题231

主要参考文献233

附录 缩略语表234

索引245